I metabolits imunomodulador inn una carateristega ciav del microambient del tumor (TME), ma cont una quai ecezion, i so identitaa resten per la plupart descognossude. Chichinscì, g’hem analizà i tumur e i celùl T di tumur e di asciti di pazient cun carcinoma seros de volt grad (HGSC) per rivelar el metabolom de chesti diferent cumpartiment TME. L'ascite e i cellule tumorai g'hann grandi diferenze de metabolit. Rispet a l’ascite, i cellule T qe infiltran ind el tumor inn signifegadivament ariqide de 1-metilnicotinamida (AMN). Anca se el nivell de MNA ind i cellule T l’è elevad, l'espression de la N-metiltransferasi de la nicotinamida (un enzima qe al cataliza el trasferiment de grup de metil de la S-adenosilmetionina a la nicotinamida) l'è limitada ai fibroblasts e ai cellule tumorai. Funzionalment, l'AMN l'indux i cellule T a secerner la citoqina qe la promov el tumor, el fator alfa de necrosi del tumor. Donca, l'MNA derivad del TME al contribuiss a la regolazion imunitaria dei cellule T e al representa un potenzial obietiv de imunoterapia per el traitament del canqer uman.
I metabolits derivads del tumor pœden haver-g un profond efet inibitor su l'imunitaa antitumoral, e semper plussee prœve mostren qe pœden anca servir comè forza motrix ciav per la progression de la malatia (1). Olter a l’efet Warburg, un lavurà recent g’ha cumincià a caraterizar el stat metabolich di celùl tumorai e la sò relaziun cunt el stat imunitari del microambient tumoral (TME). I studi sui modei de rat e sui cellule T umane hann mostrad qe el metabolism de la glutamina (2), el metabolism ossidativ (3) e el metabolism del glucosio (4) pœden ajir indipendentement su vari sotagrup de cellule imunitarie. Divers metabolits in qei vie qì inibissen la fonzion antitumoral dei cellule T. L’è stait demostrad qe el bloc del coenzima tetraidrobiopterina (BH4) al pœl dannegiar la proliferazion dei cellule T e l'aument de BH4 ind el corp al pœl meiorar la resposta imunitaria antitumoral mediada del CD4 e del CD8. Ancamò, l’efet imunosopresif de la cinurenina pœu vèss salvà cun la somministraziun de BH4 (5). Ind el glioblastoma mudant de l’isocitrad deidrojenasi (IDH), la secrezion de l’idrossiglutarad enantiometaboleg (R-2-HG) l’inibix l’ativar, la proliferazion e l’ativitaa de citolisi dei cellule T (6). Recentement, l’è stait demostrad qe el metilgliossal, un sotaprodot de la glicolisi, l’è prodot de cellule supressore de orijin mieloid, e el trasferiment cellular T del metilgliossal al pœl inibir la fonzion dei cellule T efetor. Ind el traitament, la neutralizazion del metilgliossal la pœl superar l'ativitaa dei cellule supressore derivade dei mieloids (MDSC) e meiorar sinerjetegament la terapia de blocad del pont de controll ind i modei de rat (7). Qei studi qì sotlinien colletivament el rœl ciav dei metabolits derivads del TME ind la regolazion de la fonzion e de l'ativitaa dei cellule T.
La disfunziun di celùl T l’è stada ampiament segnalada in del cancher ai ovari (8). Quest l’è in part dovud ai carateristege metabolege inerent a l’ipossia e a la vascolatura anormal del tumor (9), qe la se traduss ind la conversion del glucosi e del triptofan in sotaprodots comè l’acid laiteg e la cinurenina. El laitad extracellular ecessiv al reduss la produzion de interferon-γ (IFN-γ) e al guida la diferenziazion dei sotagrup mielosupressiv (10, 11). El consum de triptofan l’inibiss diretament la proliferazion dei cellule T e l’inibiss la segnalazion dei recetor dei cellule T (12-14). Nonostant qei osservazion qì, tant lavorar intorn al metabolism imunitari l'è stait fait in vitro cont la coltura de cellule T cont l'utilizar media otimizads, o limitads a modei omolog de rat in vivo, nissun dei quai al riflet completament l'eterojeneitaa dei canqer uman e l'ambient macro e micro fisiolojeg.
Una carateristega comuna del canqer ai ovari l’è la difusion peritoneal e la comparsa de l’ascite. L’accumul de liquid celùlar in del ascite l’è asocià a una malatia avanzada e a una pronostich scadent (15). Segond i raports, qell compartiment uneg qì l’è iposseg, al g’ha dei volts nivei de fator de la cressida endotelial vascolar (VEGF) e indoleamina 2,3-diossijenasi (IDO), e l’è infiltrad de cellule regoladore T e de cellule inibitore mieloide (15-18). L'ambient metaboleg de l'ascite al pœl vesser diferent de quell del tumor medesim, donca la riprogramazion dei cellule T ind el spazi peritoneal l’è miga ciara. De soraplu, i diferenze ciav e l'eterojeneitaa intra l'ascite e i metabolits presents ind l'ambient del tumor pœden ostacolar l'infiltrazion dei cellule imunitarie e la soa fonzion sui tumor, e l'è necessaria ulterior recerca.
Per risolver chesti prublem, g’hem prugetà un metud de spettrometria de mass en tandem de separaziun celùlar sensibil e cromatografia liquid (LC-MS/MS) per stüdiar diferent tip de celùl (anca i celùl T CD4 + e CD8 +) e anca denter e intra i tumur I sò metabolit spantegan i celùl in del stess ascite e in del ambient del pazient del tumur. Duperam qell metod qì insema a la citometria a fluss a volta dimension e al sequenziament de l'ARN unicellular (scRNA-seq) per fornir un ritratt altamente risolt del stat metaboleg de qei popolazion ciav qì. Chestu metud g’ha rivelà un aument significatif del nivell de 1-metilnicotinamida (AMN) en i celùl T del tumur e i esperiment in vitro g’han mustrà che l’efet imunomodulatur del MNA sü la funziun di celùl T l’era prima minga cognussü. In jeneral, qell metod qì al rivela i interazion metabolege reciproqe intra i tumor e i cellule imunitarie, e al forniss informazion unege sui metabolits de la regolazion imunitaria, qe pœden vesser utii per el traitament de l'imunoterapia del canqer ai ovari basada sui cellule T Oportunitaa de traitament.
Duperam la citometria a fluss a volta dimensiun per quantificar cuntempuraneament l’assorbiment de glucosio [2-(7-nitrofenil-2-ossa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desossiglucosio (2-NBDG) e l’atività mitocondrial marcador tipeg qe distinguen i cellule imunitarie e i popolazion de cellule tumorai (Tabela S2 e Figura S1A). Chesta analìs g’ha mustrà che rispett ai celùl T, l’ascite e i celùl tumorai g’han di nivell de captaziun de glucosio püsee volt, ma g’han di diferenzi püsee piscinin in del atività mitocondrial. L’assorbiment medi de glucosio dei cellule tumorai [CD45-EpCAM (EpCAM)+] l’è de tri a quatr vœlte quell dei cellule T, e l’assorbiment medi de glucosio dei cellule T CD4 + l’è 1,2 vœlte quell dei cellule T CD8 +, qe l’indica qe i linfocit infiltrant del tumor ind el tumor al necessita de TME diferent). Al contrari, l'ativitaa mitocondrial ind i cellule tumorai l’è simil a quella dei cellule T CD4 + e l'ativitaa mitocondrial de tuts duu i jener de cellule l’è superior a qella dei cellule T CD8 + (Figura 1B). In jeneral, qei resultads qì rivelen el nivell metaboleg. L’ativitaa metabolega dei cellule tumorai l’è superior a quella dei cellule T CD4 + e l’ativitaa metabolega dei cellule T CD4 + l’è superior a quella dei cellule T CD8 +. Nonostant qei efets qì intra i jener de cellule, la g’è no una diferenza coerenta ind el stat metaboleg dei cellule T CD4 + e CD8 + o ind i so proporzion relative ind l'ascite rispet ai tumor (Figura 1C). Al contrari, ind la frazion dei cellule CD45, la proporzion de cellule EpCAM+ ind el tumor l’è aumentada rispet a l’ascite (Figura 1D). G’hem anca osservad una ciara diferenza metabolega intra i components de la cellula EpCAM+ e EpCAM-. I cellule EpCAM+ (tumoral) g’hann un’assorbiment de glucosio e un’ativitaa mitocondrial plussee elevade qe i cellule EpCAM-, qe l’è tant plussee volta de l’ativitaa metabolega dei fibroblasts ind i cellule tumorai ind el TME (Figura 1, E e F).
(A e B) Intensità mediana de fluorescenza (IMM) del captaziun de glucosio (2-NBDG) (A) e atività mitocondrial di celùl T CD4 + (MitoTracker ross scüro) (B) Grafich rapresentatif (a sinistra) e dati tabulà (a destra), celùl CD8 + T e celùl tumoral EpCAM + CD45-. (C) El raport intra i celùl CD4 + e CD8 + (di celùl T CD3 +) en ascite e tumor. (D) Propurziun di celùl tumorai EpCAM + en ascita e tumor (CD45-). (E e F) grafich rapresentatif (a sinistra) e dati tabulà (a destra) Ascit e celùl tumorai (2-NBDG) (E) e atività mitocondrial (ross scüro MitoTracker) (F) e dati tabulà (a destra) Asciti e celùl tumorai. (G) Grafich rapresentatif del espresiun CD25, CD137 e PD1 travers citometria a fluss. (H e I) Espresiun CD25, CD137 e PD1 süi celùl T CD4 + (H) e süi celùl T CD8 + (I). (J e K) Fenotip ingenu, de memoria central (Tcm), efetor (Teff) e memoria efetor (Tem) basads su l'espression de CCR7 e CD45RO. Imagen rapresentatif (a sinistra) e dat tabular (a destra) di celùl T CD4 + (J) e di celùl T CD8 + (K) en ascite e en tumur. Valur P determinà dal test t accuppià (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). La linea rapresenta i pazient curispundent (n = 6). FMO, fluorescenza menu vun; IFM, intensità mediana de la fluorescenza.
Ulterior analisi l’ha rivelad oltre diferenze significative intra el status fenotipeg de la cellula T altamente risolt. La memoria ativada (Figura 1, G a I) e la memoria efetor (Figura 1, J e K) ind i tumor inn tant plussee frequente de l’ascite (proporzion de cellule T CD3 +). Inscì, l’analìs del fenotip travers l’espresiun di marcadur de attivaziun (CD25 e CD137) e di marcadur de esauriment [proteina de la mort celùlar prugramada 1 (PD1)] g’ha mustrà che anca se i carateristich metabolich de chesti populaziun sun diferent (Figura S1, B a E) , Ma nissun diferenzi metabolich significatif l’è stà osservad en mod coerent ( F a I). Chesti resultà sun stà cunfermà duperand metud de imprendiment automatich per asegnar automaticamente i fenotip celùlar (21), che g’han rivelà ulteriorment la presenza de un grand nümer de celùl de midolla ossea (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) in del ascita del pazient (Figura S2A ). Intra tuts i jener de cellule identifegads, qella popolazion cellulara mieloid qì l’ha mostrad l’assorbiment de glucosi e l’ativitaa mitocondrial plussee volta (Figura S2, B a G). Qei resultads qì meten in evidenza i forts diferenze metabolege intra i multipla jener de cellule qe se trœva ind l’ascite e ind i tumor ind i pazients HGSC.
La sfida principal per cumprender i carateristich metabonomich del TIL l’è la necessità de isular campiun de celùl T de pureza, qualità e quantità sufisent di tumur. Studi recent g’han mustrà che i metud de urdinament e de arricchiment di perlin basà sü la citometria a fluss pœden purtà a cambiament in di profil di metabolit celùlar (22-24). Per superar chestu prublema, g’hem otimizà el metud de arricchiment di perlin per isular e isular TIL dal cancher ai ovari uman chirurgicamente resettà prima del analìs cun LC-MS/MS (varda Materiai e Metud; Figura 2A). Per valutar l’impat cumplesif de chestu protocoll süi cambiament di metabolit, g’hem cunfruntà i profil di metabolit di celùl T ativà di donatur san dopu el pass de separaziun di perlin sora cun di celùl che l’eran minga separà di perlin ma che sun restà sül giass. Chesta analìs de cuntrol de la qualità g’ha descuvert che g’he una volta correlaziun intra chesti dü cundiziun (r = 0,77), e la ripetibilità tecnich del grupp de 86 metabolit g’ha una volta ripetibilità (Figura 2B). Donca, qei metods qì pœden far una analisi precisa dei metabolits ind i cellule qe subissen un ariqiment de tip cellular, fornend insì la prima piataforma a volta resoluzion per identifegar i metabolits specifeg ind el HGSC, permetend insì ai persone de otegnir una comprension plussee profonda de la specificitaa cellulara del programa del metabolism sessual.
(A) Diagramma schematich del arricchiment di perlin magnetich. Prima del analìs cun LC-MS/MS, i celùl subiran tri gir consecutif de arricchiment de perlin magnetich o restan sül giasc. (B) L’efet del tip de arricchiment sü l’abundanza di metabolit. La media di tri misuraziun per ogni tip de arricchiment ± SE. La linea gris rapresenta una relaziun 1:1. La correlaziun intraclass (ICC) di misuraziun ripetù mustrada in del etichett del ass. NAD, dinucleotid de adenina de nicotinamida. (C) Diagramma schematich del fluss di lavurà del analìs di metabolit del pazient. I ascite o i tumur sun cattà sü di pazient e criocunservà. Una part piscinina de ogni campiun l’è stada analizà cun citometria a fluss, menter i olter campiun g’han subì tri gir de arricchiment per i celùl CD4+, CD8+ e CD45-. Chesti fraziun celùlar sun stà analizà duperand LC-MS/MS. (D) Mapa de calor de l’abundanza de metabolit standardizada. El dendrogramm rapresenta l’aggruppament di distanz euclide intra i campiun de Ward. (E) Analìs di compunent principal (PCA) de la mapa del metabolit del campiun, che mustra tri copi de ogni campiun, i campiun del stess pazient sun culegà de una linea. (F) El PCA del profil del metabolit del campiun cundiziunà sul pazient (cioè duperand la ridundanza parzial); el tip de campiun l’è limità del scafo cunvess. PC1, compunent principal 1; PC2, compunent principal 2.
Sucesivament, g’hem aplicà chestu metud de arricchiment per analizar 99 metabolit en i fraziun CD4 +, CD8 + e CD45 en i ascit e i tumur primari de ses pazient HGSC (Figura 2C, Figura S3A e Tabela S3 e S4). La populaziun de interess l’è responsabil del 2% al 70% del grand campiun uriginal de celùl vivent e la prupurziun di celùl varia tant intra i pazient. Dopu la separaziun di perlin, la fraziun arricchida de interess (CD4+, CD8+ o CD45-) l’è responsabil en media de püsee del 85% de tüt i celùl vivent in del campiun. Chestu metud de arricchiment permett de analizar i populaziun celùlar del metabolism di tessü tumorai del òmm, che l’è impusibel fär de grandi campiun. Duperant chestu protocoll, g’hem determinà che l-chinurenina e adenosina, chesti dü metabolit imunosupresif ben caraterizà sun stà elevà en i celùl T del tumur o en i celùl del tumur (Figura S3, B e C). Donca, qei resultads qì mostren la fedeltaa e l'abilitaa de la nostra tecnolojia de separazion cellulara e de spettrometria de mass per trovar metabolits biolojegament importants ind i tessuds dei pazients.
La nostra analisi l’ha anca rivelad una forta separazion metabolega dei jener de cellule denter e intra i pazients (Figura 2D e Figura S4A). In particolar, rispet a olter pazients, el pazient 70 l’ha mostrad carateristege metabolege diferente (Figura 2E e Figura S4B), indicand qe la pœl vesser-g una sostanzial eterojeneitaa metabolega intra i pazients. Vale la pena notar che rispett a olter pazient (da 1,2 a 2 litri; Tabela S1), la quantità total de ascite cattà sü in del pazient 70 (80 ml) l’era püsee piscinina. El cuntrol del eterogeneità inter-pazient durant l’analìs di compunent principal (per esempi, duperand l’analìs de redundanza parzial) mustra cambiament coerent intra i tip celùlar e i tip celùlar e/o el microambient sun chiarament agregà segond el profil del metabolit (Figura 2F). L'analisi dei singoi metabolits l'ha sotliniad qei efets qì e l'ha rivelad diferenze significative intra i jener de cellule e el microambient. Vale la pena notar qe la diferenza plussee estrema osservada l’è l’MNA, qe l’è de solit richid ind i cellule CD45- e ind i cellule CD4+ e CD8+ qe se infiltran ind el tumor (Figura 3A). Per i cellule CD4+, qell efet qì l'è plussee evident, e l'AMN ind i cellule CD8+ al someia anca vesser fortament influenzad de l'ambient. Però, chestu l’è minga impurtant, perché sultant tri di ses pazient pœden vèss valutà per i puntegg CD8+ del tumur. De soraplu a l'AMN, in divers jener de cellule ind l'ascite e ind i tumor, oltr metabolits qe inn mal caraterizads ind el TIL inn anca diferenzialment ricc (Figure S3 e S4). Donca, qei dats qì rivelen un insema prometent de metabolits imunomodulador per ulterior recerca.
(A) Contenut nurmalizà de MNA en i celùl CD4+, CD8+ e CD45- de ascita e tumur. El grafich de la scatola mustra la mediana (linea), l’interval interquartil (cerniera del quader) e l’interval di dat, fin a 1,5 volt l’interval interquartil (barba del quader). Cuma descrivuu en Materiai e metud del pazient, dupera el valur limma del pazient per determinar el valur P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Diagramma sqemateg del metabolism de l’AMN (60). Metabolit: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-omocisteina; NA, nicotinamida; AMN, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-carbossamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carbossamida; NR, ribosa de nicotinamida; NMN, mononucleotid de nicotinamida. Enzimi (verd): NNMT, N-metiltrasferasi de la nicotinamida; SIRT, sirtuin; NAMPT, trasferasi fosforibosil de nicotinamida; AOX1, aldeid ossidasi 1; NRK, chinasi ribosida de la nicotinamida; NMNAT, trasferasi de adenilat mononucleotid de nicotinamida; Pnp1, fosforilasi del nucleosid de la purina. (C) t-SNE de scRNA-seq de ascita (grigio) e tumur (ross; n = 3 pazient). (D) Espresiun NNMT en diferenti populaziun celùlar identificà duperand scRNA-seq. (E) Espresiun de NNMT e AOX1 en SK-OV-3, rén embriunal del òmm (HEK) 293T, celùl T e celùl T tratà cun MNA. L’espresiun piegada l’è mustrada rispett a SK-OV-3. El mudel de espresiun cun SEM l’è mustrà (n = 6 donatur san). I valur Ct magiur de 35 sun cunsiderà minga rilevabil (UD). (F) Espresiun de SLC22A1 e SLC22A2 en SK-OV-3, HEK293T, celùl T e celùl T tratà cun MNA 8 mM. L’espresiun piegada l’è mustrada rispett a SK-OV-3. El mudel de espresiun cun SEM l’è mustrà (n = 6 donatur san). I valur Ct magiur de 35 sun cunsiderà minga rilevabil (UD). (G) Contenut de MNA celùlar en celùl T donatur san ativà dopu 72 ur de incubaziun cun MNA. El mudel de espresiun cun SEM l’è mustrà (n = 4 donatur san).
L'MNA l'è prodot col trasferir el grup metil de la S-adenosil-1-metionina (SAM) a la nicotinamida (NA) per la N-metiltrasferasi de la nicotinamida (NNMT; figura 3B). La NNMT l’è soraespressa ind una varietaa de canqer uman e l’è associada cond la proliferazion, l'invasion e i metastasi (25-27). Per cumprender meji la funt de MNA en i celùl T en TME, g’hem duperà scRNA-seq per caraterizar l’espresiun de NNMT intra tip celùlar en ascite e en tumur de tri pazient HGSC (Tabela S5). L’analisi de circa 6.500 celùl g’ha mustrà che en ascite e ambient tumorai, l’espresiun NNMT l’era limitada ai presünt populaziun de fibroblast e celùl tumorai (Figura 3, C e D). Vale la pena notar qe la g'è no un'espression NNMT ovvia in qualsessia popolazion qe l'esprim PTPRC (CD45 +) (Figura 3D e Figura S5A), qe l'indica qe l'MNA rilevad ind el spetri dei metabolit l'è stait introdot ind i cellule T. L'espression de l'aldeid ossidasi 1 (AOX1) la convertiss l'AMN in 1-metil-2-piridon-5-carbossamida (2-PYR) o 1-metil-4-piridona-5-carbossamida (4-PYR); La figura 3B) l’è anca limitada a la popolazion de fibroblasts qe esprimen COL1A1 (Figura S5A), qe insema indiqen qe i cellule T mancan de l'abilitaa del metabolism MNA convenzional. El mudel de espresiun de chesti jen ligà al MNA l’è stà verificà duperand un segond insema de dati celùlar indipendent de ascite di pazient HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Ancamò, l’analìs quantitativa de la reaziun a cadena de la polimerasi (qPCR) di celùl T donatur san tratà cun MNA g’ha mustrà che rispett ai celùl tumorai ovarian SK-OV-3 de cuntrol, NNMT o AOX1 l’eran quasi minga espress (Figura 3E). Qei resultads miga spetads qì indiqen qe l'AMN al pœl vesser secernid dei fibroblasts o dei tumor ind i cellule T adiacent ind el TME.
Anca se i candidà includen la famèja di trasportadur de catiun organich de 1 a 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) cudificà de la famèja del portadur solubil 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), i trasportadur putenziai del MNA sun ancamò minga definì (28). El QPCR del mRNA de celùl T donatur san g’ha mustrà bas nivell de espresiun de SLC22A1 ma nivell minga rilevabil de SLC22A2, che g’ha cunfermà che l’era stà ripurtà prima in de la leteratür (Figura 3F) (29). Al cuntrari, la linea celùlar del tumur ovarian SK-OV-3 g’ha espress di volt nivell de tüt i dü trasportadur (Figura 3F).
Per testar la pusibilità che i celùl T g’han la capacità de assorbir MNA forest, i celùl T donatur san sun stà cultivà per 72 our en presenza de diferenti cuncentraziun de MNA. In assenza de MNA esojen, el contegnud cellular de MNA al pœl miga vesser rilevad (Figura 3G). Però, i celùl T ativad tratà cun MNA esogen g’han mustrà un aument dipendent de la dosi del contenüu de MNA en i celùl, fin a 6 mM MNA (Figura 3G). Qell resultad qì l'indica qe, nonostant el bas nivell de espression del trasportador e la mancanza de l'enzima principal responsabel del metabolism intracellular del MNA, el TIL al pœl ancamò ciapar el MNA.
El spetri dei metabolits ind i cellule T dei pazients e i esperiments de assorbiment de MNA in vitro aumenten la possibilitaa qe i fibroblasts associads al canqer (CAF) secernen MNA e i cellule tumorai pœden regolar el fenotip e la fonzion de la TIL. Per determinar l'efet del MNA sui cellule T, i cellule T donador sane inn staite ativade in vitro in presenza o assenza de MNA e la soa proliferazion e la produzion de citoqine inn staite valutade. Dopu 7 dì de agiunta de MNA a la dosi püsee volta, el nümer de duplicaziun de la populaziun l’è stà moderatament redut, menter el vigur l’è stà mantegnuu a tüt i dosi (Figura 4A). Ancamò, el tratament del MNA esogen g’ha purtà a un aument de la prupurziun di celùl T CD4 + e CD8 + che esprimen el fatur de necrosi tumoral-α (TNFα; figüra 4B). Al contrari, la produzion intracellular de IFN-γ l’è staita signifegadivament redota ind i cellule T CD4 +, ma miga ind i cellule T CD8 + e g’è stait no un cambiament significativ ind l’interleuqina 2 (IL-2; Figura 4, C e D). Donca, el test imunosorbent ligà ai enzimi (ELISA) di süpernatant de chesti cültür de celùl T tratà cun MNA g’ha mustrà un aument significatif de TNFα, una diminuziun de IFN-γ e nissun cambiament de IL-2 (Figura 4, E a G). . La diminuzion de l'IFN-γ l'indica qe l'MNA al pœl jogar una part ind l'inibizion de l'ativitaa antitumoral dei cellule T. In manera de simular l'efet del MNA su la citotossicitaa mediada dei cellule T, i cellule T del recetor antijen qimereg (FRα-CAR-T) qe miren ai recetor folat α e CAR-T (GFP) regolads de la proteina fluoressenta verda (GFP) -CAR-T) inn prodote de cellule de sang perifereg de donador san (mononular de sang PBMC). I celùl CAR-T sun stà cultivà per 24 our en presenza de MNA e dopu co-cultivà cun i celùl tumorai ovarian SK-OV-3 del òmm che esprimen el recetur folat α a un raport efetor/obietif de 10:1. El tratament cun MNA g’ha purtà a una diminuziun significativa del atività de mort di celùl FRα-CAR-T, che l’era simil ai celùl FRα-CAR-T tratà cun adenosina (Figura 4H).
(A) Cuntegg total di celùl vitai e duplicaziun de la populaziun (PD) diretament de la cültüra el dì 7. El grafich a bar rapresenta la media + SEM de ses donatur san. Rapresenta di dat de almenu n = 3 esperiment indipendent. (B a D) CD3/CD28 e IL-2 sun stà duperà per ativar i celùl T ai luur respetif cuncentraziun de MNA per 7 dì. Prima del analìs, i celùl sun stà stimulà cun PMA/ionomicina cun GolgiStop per 4 our. Espresiun de TNFα (B) en i celùl T. Imajen de esempi (a sinistra) e dats tabular (a destra) de l'espression TNFα ind i cellule vivente. Espresiun IFN-γ (C) e IL-2 (D) en i celùl T. L'espression dei citoqine l'è staita mesurada cont la citometria a fluss. El grafich a bar rapresenta la media (n = 6 donatur san) + SEM. Duperà l’analìs a sens unich de la varianza e di misur ripetù (*P<0,05 e **P<0,01) per determinar el valur P. Rapresenta di dat de almenu n = 3 esperiment indipendent. (E a G) CD3/CD28 e IL-2 sun stà duperà per ativar i celùl T ai luur respetif cuncentraziun de MNA per 7 dì. El medium l’è stà cattà sü prima e dopu 4 o de stimolaziun PMA/ionomicina. I cuncentraziun de TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) sun stà mesurà cun ELISA. El grafich a linee rapresenta la media (n = 5 donatur san) + SEM. Valur P determinà duperand l’analìs a sens unich de la varianza e i misuraziun ripetù (*P<0,05). La linea puntegiada indica el limit de rilevament del rilevament. (H) Test de lisi celùlar. I celùl FRα-CAR-T o GFP-CAR-T sun stà agiustà cun adenosina (250μM) o MNA (10 mM) per 24 our, o lassà minga tratà (Ctrl). L’è stada mesürada la percentual de mort di celùl SK-OV-3. Valur P determinà del test t de Welch (*P<0,5 e **P<0,01).
Per otegnir una comprension mecanistega de la regolazion de l'espression TNFα dipendenta del MNA, inn staits valutads i cambiaments ind l'ARNm TNFα dei cellule T traitade cont MNA (Figura 5A). I cellule T donadore sane tratade cont MNA hann mostrad un aument dopl dei nivei de trascrizion del TNFα, qe l’indica qe el MNA l’è dipendent de la regolazion trascrizional del TNFα. Per indagar qell possibel mecanism de regolazion qì, duu fator de trascrizion cognossuds qe regolen el TNFα, çoè el fator nuclear de la cellula T ativada (NFAT) e la proteina specifega 1 (Sp1), inn staits valutads in resposta al legam del MNA al promodor TNFα prossimal ( 30 ). El promodor TNFα al contegn 6 sits de ligament NFAT identifegads e 2 sits de ligament Sp1, qe se soraponden ind un sit [-55 cobie de bas (bp) del 5'cap] (30). L'imunoprecipitazion de la cromatina (ChIP) l'ha mostrad qe quand qe l'è stait traitad cont MNA, el ligam de Sp1 a'l promodor TNFα l'è aumentad de tre vœlte. L’incorporaziun del NFAT l’è anca aumentada e s’è avvicinada a l’impurtanza (Figura 5B). Qei dats qì indiqen qe l'MNA al regola l'espression de TNFα a travers la trascrizion Sp1 e ind una misura minora l'espression de NFAT.
(A) Confrontad cond i cellule T coltivade senza MNA, el cambiament de piega de l'espression TNFα ind i cellule T traitade cont MNA. El mudel de espresiun cun SEM l’è mustrà (n = 5 donatur san). Rapresenta di dat de almenu n = 3 esperiment indipendent. (B) El promotur TNFα di celùl T tratà cun o senza MNA 8 mM dopu che NFAT e Sp1 sun stà cumbinà cun (Ctrl) e stimolaziun PMA/ionomicina per 4 our. L’imunoglobulina G (IgG) e H3 sun stà duperà rispettivament cuma cuntrol negatif e pusitif per l’imunoprecipitaziun. La quantifegazion de ChIP l’ha mostrad qe el ligam de Sp1 e NFAT al promodor TNFα ind i cellule tratade cont MNA l’è aumentad diverse vœlte rispet a’l controll. Rapresenta di dat de almenu n = 3 esperiment indipendent. Valur P determinà de plü test t (*** P <0,01). (C) Rispet a l’ascite de HGSC, i celùl T (minga citotossich) g’han mustrà un’espresiun aumentada de TNF in del tumur. I culur rapresentan pazient diferent. I celùl visualizà sun stà campiunà casualment a 300 e s’ciapà per limitar el soradisegn (** Padj = 0,0076). (D) Mudel propost de MNA per el cancher ai ovari. L'MNA l'è prodot ind i cellule tumorai e ind i fibroblasts ind el TME e l'è assorbid dei cellule T. L'MNA l'aumenta el legam de Sp1 a'l promodor TNFα, col portar a un aument de la trascrizion TNFα e a la produzion de citoqine TNFα. L'MNA al causa anca una diminuzion de l'IFN-γ. L'inibizion de la fonzion dei cellule T la porta a una reduzion de l'abilitaa de matar e a una cressida acelerada del tumor.
Segond i raport, el TNFα al g’ha efets antitumoral e antitumoral dipendents del front e del retro, ma al g’ha un rœl ben cognossud ind la promozion de la cressida e de la metastasi del canqer ai ovari (31-33). Segond i raport, la cuncentraziun de TNFα in di ascite e in di tessü tumorai in di pazient cun cancher ai ovari l’è superiur a chela in di tessü benign (34-36). In termen de mecanism, el TNFα al pœl regolar l'ativar, la fonzion e la proliferazion dei globul bianc e cambiar el fenotip dei cellule tumorai (37, 38). Coerent cun chesti resultà, l’analìs del espresiun genich diferenzial g’ha mustrà che el TNF l’era significativament regulà en volt en i celùl T en i tessü tumorai rispett al ascite (Figura 5C). L'aument de l'espression del TNF l'era evident domà ind i popolazion de cellule T cont un fenotip miga citotosseg (Figura S5A). In sintesi, qei dats qì sostegnen l'opinion qe l'MNA al g'ha dobe efets imunosupressiv e de promozion del tumor ind el HGSC.
L'etichetadura fluoressenta basada su la citometria a fluss l'è diventada el metod principal per studiar el metabolism TIL. Chesti stüdi g’han mustrà che rispett ai linfocit del sàang periferich o ai celùl T di orgen linfoid segondari, i TIL murin e del òmm g’han una tendenza magiur a assorbir el glucosio (4, 39) e la perdita gradual de la funziun mitocondrial (19, 40). Anca se g’hem osservad resultads simil in qell studi qì, el desvilup fondamental l’è el confrontar el metabolism dei cellule tumorai e la TIL de l’istess tessu tumoral resetad. Coerent cun quaivun de chesti raport precedent, i celùl tumorai (CD45-EpCAM +) de ascite e tumor g’han un assorbiment de glucosio püsee volt di celùl T CD8 + e CD4 +, suportand che l’assorbiment volt de glucosio di celùl tumorai pœu vèss cunfruntà cunt i celùl T. El concet de competizion dei cellule T. TME. A bon cunt, l'ativitaa mitocondrial dei cellule tumorai l'è superior a qella dei cellule T CD8 +, ma l'ativitaa mitocondrial l'è simil a quella dei cellule T CD4 +. Chesti resultà rinfurzan el tema emergent che el metabolism ossidatif l’è impurtant per i celùl tumorai (41, 42). I sujerissen anca qe i cellule T CD8 + pœden vesser plussee suscetibei a la disfonzion ossidativa qe i cellule T CD4 +, o qe i cellule T CD4 + pœden drovar font de carboni diferent del glucosi per mantegnir l'ativitaa mitocondrial (43, 44). Variabilment g’hem osservad nissuna diferenza ind l’assorbiment de glucosio o ind l’ativitaa mitocondrial intra i efetor T CD4 +, la memoria dei efetor T e i cellule de la memoria central T ind l’ascite. Inscì, el stat de diferenziasiun di celùl T CD8 + en i tumur g’ha minga de che far cunt i cambiament in del assorbiment de glucosio, sottalineand la diferenza significativa intra i celùl T cultivà in vitro e la TIL del òmm in vivo (22). Chesti osservaziun sun stà anca cunfermà del üs del allocaziun automatich imparzial de la populaziun celùlar, che g’ha rivelà ancamò che i celùl CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + cunt un’assorbiment de glucosio e un’atività mitocondrial magiur rispett ai celùl tumorai sun prevalent ma g’han una populaziun celùlar atif metabolich. Qella popolazion qì la pœl rapresentar la sotapopolazion putativa de cellule supressore mieloide o cellule dendritege plasmacitoide identifegade ind l'analisi scRNA-seq. Anca se tuts duu qests qì inn staits segnalads ind i tumor ovarian uman [45], i g’hann ancamò de besogn de un olter lavorar l’è per descriver qella sottopopolazion mieloida qì.
Anca se i metods basads su la citometria a fluss pœden ciarir i diferenze jenerai ind el glucosi e ind el metabolism ossidativ intra i jener de cellule, i metabolits precis prodots del glucosi o de oltre font de carboni per el metabolism mitocondrial ind el TME inn miga ancamò staits determinads. L'assegnazion de la presenza o de l'assenza de metabolits a un cert sotainsema TIL la necessita de la purificazion de la popolazion cellulara del tessud escis. Donca, el noster metud de arricchiment celùlar cumbinà cun la spettrometria de mass pœu furnir di infurmaziun süi metabolit che sun arichi diferenzialment en celùl T e en populaziun de celùl tumorai en campiun de pazient curispundent. Anca se qell metod qì al g’ha dei vantaj su la classificazion cellulara ativada de la fluorescenza, certe bibliotege de metabolits pœden vesser influenzade a causa de la stabilitaa inerenta e/o del tass rapid de rotazion (22). Però, el noster metud l’è stà bon de identificar dü metabolit imunosupressif recognossuu, adenosina e cinurenina, perché varian tant intra i tip de campiun.
La nostra analisi metabonomega dei tumor e dei sotatip TIL la forniss plussee informazion sul rœl dei metabolits ind la TME ovariana. Prim, duperand la citometria a fluss, g’hem determinà che g’he l’era no diferenza in del atività mitocondrial intra i tumur e i celùl T CD4 +. A bon cunt, l'analisi LC-MS/MS l'ha rivelad cambiaments significativ ind l'abundanza de metabolits intra qei popolazion qì, qe l'indica qe i conclusion sul metabolism TIL e la soa ativitaa metabolega complessiva i g'hann de besogn de un'atenta interpretazion. Segund, l'MNA l'è el metabolit cont la diferenza plussee granda intra i cellule CD45 e i cellule T ind l'ascite, miga ind i tumor. Donca, la compartimentazion e la posizion del tumor pœden haver-g efets diferents sul metabolism TIL, qe al sotlinia la possibel eterojeneitaa ind un cert microambient. Terz, l'espression de l'enzima produtor de MNA NNMT l'è principalment limitada a la CAF, qe l'è dei cellule tumorai ind una misura minora, ma i nivei de MNA rilevabei inn osservads ind i cellule T derivade del tumor. La soraespression de NNMT ind la CAF ovaria la g’ha un efet cognossud qe al favoriss el canqer, in part dovud a la promozion del metabolism de la CAF, l’invasion del tumor e i metastasi (27). Anca se el nivell cumplesif de TIL l’è moderà, l’espresiun de NNMT en CAF l’è streitament ligada al sottatip mesenchimal del Atlant del genoma del cancher (TCGA), che l’è asocià a una pronostich scadent (27, 46, 47). Finalment, l'espression de l'enzima AOX1 responsabel de la degradazion del MNA l'è anca limitada a la popolazion CAF, qe l'indica qe i cellule T mancan de l'abilitaa de metabolizar el MNA. Qei resultads qì sostegnen l'idea qe anca se l'è necessari ulterior lavorar per verifegar qella descoverta qì, i volts nivei de MNA ind i cellule T pœden indicar la presenza de un microambient CAF imunosupressiv.
Dat el bas nivell de espresion dei trasportador de MNA e i nivei miga rilevabei de proteine ​​ciav coinvoljude ind el metabolism de MNA, la presenza de MNA ind i cellule T l’è miga spetada. Né NNMT né AOX1 pœden vèss rilevà travers l’analìs scRNA-seq e qPCR mirad a dü coort indipendent. Qei resultads qì indiqen qe l'MNA l'è miga sintetizad dei cellule T, ma assorbid del TME circostante. I esperiments in vitro mostren qe i cellule T tenden a accumular l'AMN esojen.
I noster studi in vitro hann mostrad qe l'MNA esojen l'indux l'espression de TNFα ind i cellule T e l'aumenta el legam de Sp1 al promodor TNFα. Anca se el TNFα al g’ha fonzion antitumoral e antitumoral, ind el canqer ai ovari, el TNFα al pœl promover la cressida del canqer ai ovari (31-33). La neutralizazion del TNFα ind la coltura dei cellule del tumor ovarian o l'eliminazion del segnal TNFα ind i modei de rat la pœl meiorar la produzion de citoqine inflamatrix mediade del TNFα e inibir la cressida del tumor (32, 35). Donca, in qell cas qì, l'MNA derivad del TME al pœl ajir comè un metabolit proinfiamatori a travers de un mecanism dipendent del TNFα a travers el circol autocrin, promovend insì l'ocorenza e la difusion del canqer ai ovari (31). In su la bas de chesta pusibilità, el blocch TNFα l’è stüdià cuma putenzial ajent terapeutich per el cancher ai ovai (37, 48, 49). De soraplu, l'MNA al compromet la citotossicitaa dei cellule CAR-T ai cellule tumorai ovariane, col fornir oltre prœve de la supresion imunitaria mediada del MNA. Insema, qei resultads qì sujerissen un modell indov qe i tumor e i cellule CAF secernen MNA ind el TME extracellular. Travers (i) la stimolazion de la cressida del canqer ai ovari indota del TNF e (ii) l'inibizion de l'ativitaa citotossega dei cellule T indota del MNA, quest al pœl haver-g un dopi efet tumoral (Figura 5D).
In conclusiun, aplicand una cumbinaziun de arricchiment celùlar rapid, sequenziament unicelùlar e profilaziun metabolich, chestu stüdi g’ha rivelà i enorm diferenzi imunometabolomich intra i tumur e i celùl de ascita en pazient HGSC. Qella analisi completa qì l'ha mostrad qe g'è dei diferenze ind l'assorbiment del glucosi e ind l'ativitaa mitocondrial intra i cellule T, e l'ha identifegad el MNA comè un metabolit regolador imunitari autonom miga cellular. Chesti dat g’han un impatt sü cuma la TME influiss sul metabolism di celùl T in di cancher del òmm. Anca se l'è staita segnalada la competizion direta per i nutrients intra i cellule T e i cellule tumorai, i metabolits pœden anca ajir comè regolador indirets per favorir la progression del tumor e fors soprimer i resposts imunitarie endojene. L'ulterior descrizion del rœl fonzional de qei metabolits regolador qì la pœl dervir stratejie alternative per meiorar la resposta imunitaria antitumoral.
I campion di pazient e i dat clinich sun stà ottegnuu travers del archivi di tessü del tumur del cancher BC certificà de la red canades del archivi di tessü. Segond el protocoll apruvà del Comitat Etich de la Ricerca sul Cancher BC e del Università de la Columbia Britannich (H07-00463), tüt i campiun e i dat clinich di pazient g’han ottegnuu un cunsens scrivü informad o g’han rinunzià furmalment a luur cunsens. I campiun sun cunservà in de la Biobanca certificada (BRC-00290). I carateristich detaià di pazient sun mustrà en i tabei S1 e S5. Per la crioconservaziun, un bisturi l’è duperà per decomponer mecanicament el campiun del tumur del pazient e dopu spincel travers de un filter de 100 micron per ottener una suspensiun celùlar singula. L’ascite del pazient l’è stada centrifugada a 1500 rpm per 10 minut a 4°C per pelletar i celùl e scancelà el süpernatant. I celùl ottenü dal tumur e dal ascit sun stà criocunservà in del 50% de sèrum AB del òmm inatì al calor (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Scientifich Thermo Fisher) e 10% sulfossid de dimetil. Chesti suspensiun de celùl singul cunservà sun stà disgellà e duperà per la metabolomich e la determinaziun di metabolit descrivuu di sotta.
El mez cumplet l’è furmà de 0,22 μm filtrà 50:50 integrà RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (termofisher scientifich) integrada cun sèrum AB uman inativà al calor al 10% (Sigma-Aldrich), 12,5 mM epes (termofisher scientifich), 2 mM l-glutamina (termofisher scientifich) Soluziun de streptomicina (PenStrep) e mercaptoetanol de 50 μMB. AimV (Invitrogen) l’è integrà cun 20 mM de Hepes (termofisher scientifich) e 2 mM de l-glutamina (termofisher scientifich). El tampon de coloraziun del citometer de fluss l’era furmà de 0,22 μm de soluziun salina tamponada cun fosfat filtrada (PBS; Invitrogen) integrada cunt el 3% de sèrum uman AB inativà al calor (Sigma). El tampon de arricchiment celùlar l’è cumpost de PBS filtrà de 0,22 μm e integrà cun 0,5% de sèrum AB del òmm inativà al calor (Sigma-Aldrich).
En un mez cumplet a 37°C, i celùl sun stà culurà cun 10 nM MT DR e 100 μM 2-NBDG per 30 minut. Dopu, i celùl sun stà culurà cun colorant de vitalità eF506 a 4°C per 15 minut. Risuspend i celùl in del blocch FC (eBioscience) e in del tampon de coloraziun brillant (BD Biosciences), diluì en tampon de coloraziun del citometer a fluss (segond i istruziun del produtur) e incuba per 10 minut a temperadüra ambient. Colorar i celùl cunt un insema de anticorp (Tabela S2) en tampon de coloraziun de citometria a fluss a 4°C per 20 minut. Risuspend i celùl en tampon de coloraziun de citometria a fluss (Cytek Aurora; configuraziun 3L-16V-14B-8R) prima del analìs. Dupera SpectroFlo e FlowJo V10 per analizà i dat del cuntegg di celùl e dupera GraphPad Prism 8 per crear i dat. L’intensità mediana de fluorescenza (IMM) de 2-NBDG e MT DR l’è stada nurmalizada log e dopu l’è stà duperà un test t accuppià per l’analìs statistich per tegnir cunt di pazient curispundent. Cavar via tüt i populaziun cun menu de 40 event del analìs; inserir un valur IFM de 1 per qual-sa-vöör valur negatif prima de fär un analìs statistich e la visualizaziun di dat.
Per integrar la strategia de chiusura manual del panei de prucess sora, duperam l’annotaziun cumpleta del arbur de restriziun de la furma (FAUST) (21) per asegnar automaticamente i celùl a la populaziun dopu avegh eliminà i celùl mort en FlowJo. Gestim manualment l'output per unir popolazion qe someien vesser miga allocade (combinant PD1+ cont i cellule tumorai PD1) e popolazion retegnude. Ogni campiun g’ha denter una media de püsee del 2% di celùl, per un total de 11 populaziun.
La centrifugaziun a densità de gradient de ficoll l’è stada duperada per separar el PBMC di prudot de separaziun di leucocit (tecnologie STEMCELL). I celùl T CD8 + sun stà isulà del PBMC duperand i microperlin CD8 (Miltenyi) e slargà en mez cumplet duperand TransAct (Miltenyi) per 2 seteman segond i istruziun del produtur. I celùl sun stà lassà star per 5 dì en un mez cumplet che g’ha denter IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), e dopu stimolà ancamò cun TransAct. El dì 7, segond i istruziun del produtur, i Microperlin CD45 del òmm (Miltenyi) sun stà duperà per arricchir i celùl en tri gir consecutif. I celùl sun stà aliquotà per l’analìs de citometria a fluss (cuma descrivuu de sora), e un miliun de celùl sun stà aliquotà tri volt per l’analìs LC-MS/MS. I campiun sun stà elaborà cun LC-MS/MS cuma descrivuu disotta. A’l hem stimad el valor del metabolit mancant cont un numer de ion de 1.000. Ogni campiun l’è nurmalizà del nümer total di ion (TIC), cunvertì en mod lugaritmich e nurmalizà en mod automatich en MetaboAnalystR prima del analìs.
La suspensiun singul celùlar de ogni pazient l’è stada disgellata e filtrada travers de un filter de 40 μm en un mez cumplet (cuma descrivuu de sora). Segond el protocoll del produtor, tri gir consecutiv de selezion positiva per separazion dei perlin magnetege cont l'utilizar MicroBeads (Miltenyi) inn staits utilizads per arricchir i campion per i cellule CD8+, CD4+ e CD45- (sœ giaç). In curt, i cellule inn resuspendude ind un tampon de arriqiment cellular (comè descrivud de sora) e contade. I celùl sun stà incubà cun perlin CD8 del òmm, perlin CD4 del òmm o perlin CD45 del òmm (Miltenyi) a 4°C per 15 minut e dopu lavaa cun tampon de arricchiment celùlar. El campiun l’è passà travers de la culona LS (Miltenyi) e i fraziun pusitif e negatif sun cattà sü. In manera de redur la durada e massimizar el pass de recuper cellular, la frazion CD8 l’è pœ drovada per el segond gir de arriqiment CD4+ e la frazion CD4 l’è drovada per el sucessiv arriqiment CD45. Mantegnir la soluziun sü giasc durant tüt el prucess de separaziun.
Per preparar i campiun per l’analìs di metabolit, i celùl sun stà lavà una volta cunt una soluziun de sal frècc cuma giasc e 1 ml de metanol al 80% l’è stà giuntà a ogni campiun, dopu vortexà e cungelà en azot liquid. I campiun sun stà sottapost a tri cicli de congelament-sciogliment e centrifugà a 14.000 rpm per 15 minut a 4°C. El soranatant qe al contegn i metabolits al se evapora infina a’l sec. I metabolit sun stà redissolt en 50 μl de acid formich al 0,03%, vortexà per mes’cià e dopu centrifugà per scancelà i detriti.
Estrar i metabolits comè descrivud de sora. Trasferir el süpernatant en una buttiglia de cromatografia liquid a volt rendiment per la ricerca metabolomich. Duperà un protocoll de tratament casual per tratar ogni campiun cunt un nümer simil de celùl per prevegnir effet del lott. G’hem fait una valutazion qualitativa dei metabolits globai publegads in precedenza sul spettrometer de massa a tripla quadrupol AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L’analìs cromatografich e l’integraziun del area de picc sun stà fatt duperand el prugrama MultiQuant versiun 2.1 (Biosistèm aplicà SCIEX).
Un cuntegg de ion de 1000 l’è stà duperà per stimar el valur del metabolit mancant e el TIC de ogni campiun l’è stà duperà per calcular l’area de picc nurmalizà de ogni metabolit rilevà per currègg i cambiament introdott del analìs strümental del lavuraziun del campiun. Dopu che TIC l’è nurmalizà, l’è duperà MetaboAnalystR(51) (parameter predefinì) per la cunversiun lugaritmich e la ridimensiunament automatich de la linea di norm. G’hem duperà PCA cunt el pachet R vegan per fär un analìs esplorativa di diferenzi del metabolom intra i tip de campiun e g’hem duperà un analìs de ridundanza parzial per analizar i pazient. Dupera el metud Ward per costruir un dendrogramm de mapa de calor per raggrupar la distanza euclidea intra i campiun. A’l hem drovad la limma (52) su l'abundanza de metabolits standardizada per identifegar i metabolits diferenzialment abondants ind l'intregh tip cellular e ind el microambient. Per facilitar la spiegaziun, duperam el parameter de la media del grupp per specificar el mudel e cunsiderem i tip de celùl in del microambient cuma ogni grupp (n = 6 grupp); per la prœuva de significà, g’hem fatt tri misuraziun ripetü per ogni metabolit Per evitar una falsa replicaziun, el pazient l’è stà inclus cuma ostacul in del pruget de la limma. Per cuntrular i diferenzi in di metabolit intra pazient diferent, g’hem ajustà el mudel limma inclùs i pazient en mod fiss. Segnalam l’impurtanza del cuntrast prespecificà intra el tip celùlar e el microambient de Padj <0,05 (correziun de Benjamini-Hochberg).
Dopu l’arrichiment de vigur duperand el kit de rimoziun di celùl mort Miltenyi (>80% de vitalità), el sequenziament del trascritom unicelùlar l’è stà fatt süi campiun total de ascite e tumur cungelà vif duperand un protocoll de espresiun del gen 10x 5′. Sun stà analizà ciinch cas cun tumur e ascite curispundent, anca se la bassa redditività de un campiun de tumur g’ha impedì sò inclusiun. Per ottener plü seleziun de pazient, g’hem cumbinà i campiun de ogni pazient en i corsie del controlladur de cromo 10x e g’hem analizà separàment l’ascite e i sit del tumur. Dopu el sequenziament [Estremità accoppiada (PE) de 28 × 98 bp, genoma del Quebec; una media de 73.488 e 41.378 lettür per celùla rispettivament per tumur e ascite]], duperam CellSNP e Vireo (53) (basà sü CellSNP cuma El SNP comun del òmm (VCF) furnì de ​​GRCh38 l’è asegnà un’identidà de genotip de donatur el stat del pazient close) (IBS), esclus i celùl minga assegnà e i celùl identificà cuma duplex e donatur curispundent intra campiun de ascite e de tumur (54), g’hem mantegnuu tri cas cun rapresentaziun celùlar abundant in del tumur e in del ascit per l’analìs a vall (sc5) g’ha produtt 6975 celùl (rispettivament 2792 e 4183 celùl de tumur e ascite) per l’analìs Duperam l’aggruppament de Louvain del igraph (57) de la red visin cundivisa (SNN) basà sü la distanza de Jaccard ai celùl de raggruppament basà manualment sü l’espresiun. e visualizà cun t-SNE I celùl T citotossich sun definì del espresiun de CD8A e de GZMA, esclus i sottacluster cun bas espresiun de proteina ribosomich G’hem acess ai dat püblicà de Izar et al (16), inclùs luur incorporaziun t-SNE, pœden cuntrular l’espresiun de celùl imunitari.
I PBMC sun stà separà di prudot de separaziun di leucocit (tecnologie STEMCELL) travers la centrifugaziun a densità de gradient de Ficoll. I celùl CD3 + sun stà isulà del PBMC duperand perlin CD3 (Miltenyi). En presenza o assenza de MNA, i celùl CD3+ sun stà ativà cun CD3 ligà a placch (5 μg/ml), CD28 solubil (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; proleuchina). In del ültem dì de espansiun, la faitibilità (Tinta de Faitibilità Fissabil eFluor450, eBioscienza) e la proliferaziun (123 perlin e-cunt, Thermo Fisher Scientific) sun stà valutà cun citometria a fluss. Valutar la funziun efetur stimoland i celùl cun PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) cun GolgiStop per 4 our, e monitorar el CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), el CD4-AF700 (RPA-T4) e la TNForetiflucetiana. (MAb11, BD). Stimular i celùl qPCR e ChIP cun PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1μg/ml) per 4 our. El süpernatant ELISA l’è stà cattà sü prima e dopu la stimolaziun cun PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) per 4 our.
Segui el protocoll del produtur per isular l’ARN duperand el mini kit RNeasy Plus (QIAGEN). Duperà el trituradur QIA (QIAGEN) per omogeneizar el campiun. Duperà el kit ARN-ADNc de volta capacità (Thermo Fisher Scientific) per sintetizar l’ADN cumplementar (ADNc). Utilizar el Master Mix Avanzad Rapid TaqMan (Thermo Fisher Scientific) per quantificar l'espresion jenega (segond el protocoll del produtor) cont i seguent sund : Hs02786624_g1 [gliceraldeid-3-fosfat fœura idrogeno (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). I campiun sun stà eseguì sül sistèm PCR en temp real StepOnePlus (Biosistemi aplicà) (Biosistemi aplicà) in de la placa de reaziun ottich rapida a 96 pozz MicroAmp (Biosistemi aplicà) cun film ottich MicroAmp. Qual-sa-vöör valur Ct che süpera 35 l’è cunsiderà superiur al limit de rilevament e l’è segnà cuma minga rilevabil.
Eseguir ChIP cuma descrivuu prima (58). En curt, i celùl sun stà tratà cun formaldeid (cuncentraziun final 1,42%) e incubà a temperadüra ambient per 10 minut. Utilizar un tampon de gonfiament integrà (25 mM de Hepes, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de KCl e 0,1% de NP-40) sü giasc per 10 minut, e dopu risuspend en tampon de imunoprecipitaziun cuma descrivuu (58 ). El campiun l’è stà pœu sonicà cunt i cicli seguent: 10 cicli (20 impuls de 1 segund) e un temp statich de 40 segund. Incubar i anticorp de imunoglobulina G de grad ChIP (tecnologia de segnalaziun celùlar; 1μl), iston H3 (tecnologia de segnalaziun celùlar; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) e SP1 (tecnologia de segnalaziun celùlar; 3μl) cunt el campiun a sorapeso CC° Incubà i perlin de proteina A (Thermo Fisher Scientific) cunt el campiun a 4°C cun liger agitaziun per 1 ura, dopu duperà i perlin de chelex (Bio-Rad) per arricchir l’ADN e duperà la proteinasi K (Thermo Fisher) per la digestiun di prutein. El promodor TNFα l’è stait rilevad per PCR: innanz, GGG TAT TGT TGT TGC TGT; al cuntrari, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (prudot de 207 bp). I imagen sun stà prudott de Image Lab (Bio-Rad) e quantificà duperand el prugrama ImageJ.
El süpernatant de la cültür celùlar l’è stà cattà sü cuma descrivuu de sora. La determinaziun l’è stada fada segond i procedür del produtur del kit ELISA TNFα del òmm (Invitrogen), del kit ELISA IL-2 del òmm (Invitrogen) e del kit ELISA IFN-γ del òmm (Abcam). Segond el protocoll del produtur, el suranatant l’è stà diluì 1:100 per rilevar TNFα e IL-2 e 1:3 per rilevar IFN-γ. Dupera el letur multietichett EnVision 2104 (PerkinElmer) per mesurà l’assorbiment a 450 nm.
I PBMC sun stà separà di prudot de separaziun di leucocit (tecnologie STEMCELL) travers la centrifugaziun a densità de gradient de Ficoll. I celùl CD3 + sun stà isulà del PBMC duperand perlin CD3 (Miltenyi). En presenza o assenza de MNA, i celùl CD3+ sun stà ativà cun CD3 ligà a placch (5μg/ml), CD28 solubil (3μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; proleuchina) per 3 dì. Dopu 3 dì, i celùl sun stà cattà sü e lavà cun salina al 0,9% e el pellet l’è stà cungelà. El cuntegg celùlar l’è stà fatt cun citometria a fluss (Cytek Aurora; configuraziun 3L-16V-14B-8R) duperand 123 perlin e-cunt.
Estrar i metabolits comè descrivud de sora. L’estratt secc l’è stà ricostituì a una cuncentraziun de 4000 equivalent celùlar/μl. Analizar el campiun cun cromatografia en fas invertì (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e culonn CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, dimensiun di partisel 1,6 μm, dimensiun di por 120 Å; #186008500). Spetrometer de mass polar (6470, Agilent), induè la ionizaziun a eletrospray funziuna en modalità pusitif. La fas mobil A l’è al 0,1% de acid formeg (en H2O), la fas mobil B l’è al 90% de acetonitril, al 0,1% de acid formeg. El gradient LC l’è de 0 a 2 minut per el 100% A, de 2 a 7,1 minut per el 99% B e de 7,1 a 8 minut per el 99% B. Dopu reequilibrar la culona cun la fas mobil A a un fluss de 0,6 ml/min per 3 minut. . El fluss l’è de 0,4 ml/min e la cambra de la culona l’è scaldada a 50°C. Duperà el standard chimich pur de MNA (M320995, Società chimich de ricerca de Toronto, North York, Ontario, Canada) per stabilir el temp de ritenziun (RT) e la trasformaziun (RT = 0,882 minut, trasfurmaziun 1 = 137→94,1, trasfurmaziun 2 = 137→1237). Quant che tüt i tri transiziun se verifican al giüst temp de ritenziun, la transiziun 1 l’è duperada per la quantificaziun per garantir la specificità. La cürva standard del MNA (Società chimich de ricerca de Toronto) l’è stada generada de ses diluiziun en seri de la soluziun de riserva (1 mg/ml) per ottener di standard de 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/ml e rispettivament de 1,0 e 10 μg/ml liquid. El limit de rilevament l’è 1 ng/ml e la rispòsta linear l’è intra 10 ng/ml e 10μg/ml. Ogni inieziun de dü microlitr de campiun e standard l’è duperada per l’analìs LC/MS e un campiun de cuntrol de qualità misto l’è eseguì ogni vòtt inieziun per garantir la stabilità de la piattafurma de analìs. I rispost MNA de tüt i campiun celùlar tratà cun MNA l’eran denter del interval linear del test. L’analìs di dat l’è stada fada duperand el prugrama de analìs quantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
El costrut αFR-CAR de segonda jenerazion l’è stait prelevad de Song et al. (59). In curt, el costrut al contegn i contegnuds seguents : sequenza de leader CD8a, ciapell variabel a cadena singola specifeg de l'αFR uman, cerniera CD8a e rejon trasmembrana, domini intracellular CD27 e domini intracellular CD3z. La sequenza CAR cumpleta l’è stada sintetizada de GenScript e dopu clùnada in del vetur de espresiun lentiviral de segonda generaziun a vall de la cassetta de espresiun GFP duperada per valutar l’eficienza de la traduziun.
El lentivirus l’è prodot per la trasfezion de cellule HEK293T [Collezion de coltura de tip amerigana (ATCC); cressü in del mez Eagle mudificà de Dulbecco che g’ha denter el 10% de sèrum bovin fetal (FBS) e l’1% de PenStrep, e duperà el vetur CAR-GFP e i plasmid de imballagg (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) duperan l’amina de lipofeziun (Sigma-Aldrich). El soranatant che g’ha denter el virus l’è stà cattà sü 48 e 72 o dopu la trasfeziun, filtrà e cuncentrà per ultracentrifugaziun. Cunservà el süpernatant viral cuncentrà a -80°C fin a la traduziun.
I PBMC sun separà di prudot de separaziun di leucocit de donatur san (tecnologie STEMCELL) travers la centrifugaziun a densità de gradient de Ficoll. Utilizar microperlin CD8 de selezion positiva (Miltenyi) per isolar i cellule CD8+ del PBMC. Stimular i celùl T cun TransAct (Miltenyi) e en mez TexMACS [Miltenyi; integrà cun 3% de sèrum uman inativà al calor, 1% de PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Ventiquater o dopu la stimolaziun, i celùl T sun stà trasdù cun lentivirus (10 μl de suranatant de virus cuncentrà per 106 celùl). 1 a 3 dì dopu la traduziun sü Cytek Aurora (sü FSC (diffusiun en avanti)/SSC (diffusiun lateral), Singlet, GFP+), valutar l’espresiun GFP di celùl per dimustrar un’eficienza de traduziun de almen el 30%.
I celùl CAR-T sun stà cultivà per 24 ur en Immunocult (tecnologie STEMCELL; integrà cun l’1% de PenStrep) en i cundiziun seguent: minga tratà, tratà cun 250 μM de adenosina o 10 mM de MNA. Dopu el pretrattament, i celùl CAR-T sun stà lavà cun PBS e cumbinà cun 20.000 celùl SK-OV-3 [ATCC; en mez McCoy 5A (Sigma-Aldrich) integrà cun 10% de FBS e 1% de PenStrep a 10: el raport efetur/obietif de 1 l’è stà amplificà en triplicà en mez imunocult integrà. I celùl SK-OV-3 e i celùl SK-OV-3 lisà cun saponina digitalis (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) sun stà duperà rispettivament cuma cuntrol negatif e pusitif. Dopu 24 ur de co-cültivaziun, el süpernatant l’è stà cattà sü e la latat desidrogenasi (LDH) l’è stada mesurà segond i istruziun del produtur (Kit de test de citotossicità Glo LDH, Promega). El süpernatant LDH l’è stà diluì 1:50 en tampon LDH. La percentual de mort l’è stada mesürada duperand la formula seguent: percentual de mort = percentual de curreziun / tass massim de mort x 100%, induè la percentual de curreziun = sultant celùl T de co-cültür e tass massim de mort = cuntrol pusitif-cuntrol negatif.
Cuma descrivuu in del test o in di materiai e in di metud, dupera GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 per l’analis statistich. Se sun cattà sü plü campiun del stess pazient (cuma ascite e tumur), duperam un test t accoppià o includem el pazient cuma effet casual en un mudel linear o generalizà, segond el cas. Per l’analìs metabolomich, el test de impurtanza l’è fatt en triplicat.
Per i materiai suplementar per chestu articul, varda
Chestu l’è un articul a acess avèrt distribuì ai termin de la licenz de attribuziun-minga cumercial Creative Commons, che cunsent l’üs, la distribuziun e la riproduziun en qual-sa-vöör mezz, purché l’üs final l’è minga per un guadagn cumercial e la premesa l’è che l’oper uriginal l’è giüst. Riferiment.
Nota: Ti dumandem sultant de furnir el tò indiriz e-mail inscì che la persuna che te racumandi a la pagina la sa che te vœut che la veda l’e-mail e che l’è minga spam. Catturem no nissun indiriz e-mail.
Chesta dumanda l’è duperada per verificar se l’è un visitant e per evitar l’invio automatich de spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jonesrar Nelson (Brad H. Nelson), Ralph JR De Bell (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
L'MNA al contribuiss a la supresion imunitaria dei cellule T e al representa un potenzial obietiv de imunoterapia per el traitament del canqer uman.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jonesrar Nelson (Brad H. Nelson), Ralph JR De Bell (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
L'MNA al contribuiss a la supresion imunitaria dei cellule T e al representa un potenzial obietiv de imunoterapia per el traitament del canqer uman.
©2021 Asociaziun americana per el prugress de la scienza. tutti i diritti riservati. AAAS l'è un partner de HINARI, AGORA, OARE, COR, CLOCKSS, Riferiment incrocià e CONTADOR. Avanzament de la Scienza ISSN 2375-2548.