La classificazion dei proteine ​​ind la via secretora l’è essenzial per mantegnir la compartimentazion cellulara e l'omeostasi. De soraplu a la classificazion mediada de la conchiglia, el rœl dei lipids ind la classificazion de la cinesina ind el process de trasport secretori l’è una domanda de bas de longa data qe l’è miga ancamò staita risposta. Chichinscì, fasem un’imajen simultanea 3D multicolor a volta resoluzion in temp real per demostrar in vivo qe i proteine ​​imobilizade a glicosilfosfatidilinositol sintetizade de nœv cont frazion lipidege de ceramida longessime inn ragrupads e classifegads in endoplasmi specializads del sit de uscita de la proteina net, qe l’è diferent del sit de uscita de la proteina. De soraplu, mostrem qe la longeza de la cadena de la ceramida ind la membrana del reticol endoplasmeg l’è fondamental per qella seletivitaa de classificazion qì. El noster studi al forniss la prima prœva direta in vivo per classifegar i carg proteig su la bas de la longeza de la cadena lipidega in sits de esportazion seletiv ind la via secretoria.
Ind i cellule eucariotege, i proteine ​​sintetizade ind el reticol endoplasmeg (ER) a inn pœ ordinade durant el trasport a travers la via secretoria per la consegna a la soa destinazion cellular apropriada (1). De soraplu a la classificazion mediada del mantell, l’è stait per tant temp ipotizad qe certs lipids pœden anca servir comè pont de uscita seletiv col ragrupar-i in domini specifeg de membrana qe proteine ​​specifege (2-5). Comesessia, la g'è ancamò una mancanza de prœve direte in vivo per demostrar qell possibel mecanism qì basad sui lipids. Per resolver qell problema de bas qì, hem studiad ind i levads comè qe i proteine ​​ancorade del glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) inn esportade in manera diferenziada de l'ER. I GPI-AP inn una varietaa de proteine ​​de la superfix cellulara collegade ai lipids ( 6, 7). El GPI-AP l’è una proteina secernida tacada ai fogliets estern de la membrana plasmatega a travers la frazion glicolipidega (ancora GPI). Acetan i ancor GPI cuma modifich post-traslaziunai cunservatif in del lumen ER (8). Despœ de l’atacament, el GPI-AP al passa a travers l’aparat del Golgi (5, 9) de l’ER a la membrana plasmatega. La presenza de ancor GPI la fa trasportar el GPI-AP separadament dei proteine ​​secernide a trasmembrana (comprese oltre proteine ​​de la membrana plasmatega) longh la via secretora (5, 9, 10). Ind i cellule de levad, i GPI-AP inn separads de oltre proteine ​​secernide ind el reticol endoplasmeg, e pœ impachetade in vesicole unege impachetade del compless proteig del mantell II (COPII) (6, 7). I determinants de qell process de classifegazion qì ind el process de esportazion ER inn miga ciar, ma se pensa qe qell mecanism qì al pœl haver-g besogn de lipids, in particolar el rimodellament strutural de la porzion lipidega de l'ancora GPI (5, 8). Ind i levads, el rimodellament lipideg del GPI al comença subit dop qe el GPI al se taca, e in tant cas, al fa ligar la ceramida a l'acid grass saturad a cadena longa de 26 carboni (C26:0) (11, 12). La ceramida C26 l’è la ceramida principal prodota dei cellule de levad infina adess. L’è sintetizad ind l’ER e la major part l’è esportada ind l’aparat del Golgi a travers i vesicole COPII (13). L’esportaziun ER de GPI-AP dumanda specificament una sintès de ceramida cuntinua (14, 15), e a sò volta, la cunversiun de la ceramida en ceramida de fosfat inositol (IPC) in del aparechi de Golgi dipend de la sintès de ancora GPI (16). I studi biofiseg cont i membrane artifiçai hann mostrad qe i ceramide a cadena acil longa fiss pœden coalesser per formar domini ordenads cont proprietaa fisege unege (17, 18). Qei dats qì porten a l'ipotesi qe la ceramida C26 e el GPI-AP cont la ceramida C26 drœven i so proprietaa fisege per coalesser in rejon o rejon ordenade ind l'ambient lipideg de la membrana ER relativament disordinad. L’è principalment cumpost de glicerolipid curt e insatürà (C16:1 e C18:1) (19, 20). Chesti regiun seran cuncentrà seletivament sü specifich sit de uscita ER (ERES), induè la ceramida e el GPI-AP basà sü la ceramida pœden vèss co-trasportà al Golgi in de la stess vesicula COPII dedicada (5).
En chestu stüdi, g’hem testà diretament chestu mecanism basà süi lipid duperand la microscopia en temp real cunfucal a super risoluziun (SCLIM), che l’è una tecnich de microscopia d’avanguardia che pœu osservar cuntempuraneament protein marcad en mod fluoresent. (21, 22).
Prima g’hem aplicà la tecnologia SCLIM per definir ulteriorment cuma el GPI-AP nurmal cunt el grupp de ceramida C26 l’è stà schermà di protein secernì trasmembran dopu avegh lassà l’ER en S. cerevisiae. Per controllar la classifegazion de l’ER, hem drovad un sistema jeneteg qe al pœl visualizar diretament el carg sintetizad de nœv qe al entra ind l’ERES in vivo (7, 23). Comè carg, g’hem scernid el GPI-AP Gas1 a bas ceramida C26 marcad cont una proteina fluoressenta verda (GFP) e la proteina secernida trasmembrana Mid2 marcada cont una proteina fluoressenta a quasi infraross (iRFP), tuts duu qe miren a la membrana plasmatega (24-26). Ind el mudant sensibil a la temperadura sec31-1, qei duu carg qì inn espress sota un promodor induxibel a'l galattosi e un marcador ERES costitutiv. A la temperadura estrema (37°C), perqè la mudazion sec31-1 l’influiss su la fonzion del component del mantell COPII Sec31 per inibir la jermenazion de COPII e l'esportazion ER, el carg sintetizad de nœv al se accumula ind l'ER (23). Despœ de rafredar-s a una bassa temperadura (24°C), i cellule mudante sec31-1 se inn recuperade de l'area secretora e el nœv carg sinteteg accumulad l'ha començad a vesser esportad de l'ER. La visualizazion CLIM l’ha mostrad qe la major part del Gas1-GFP e del Mid2-iRFP nœv sintetizads se accumulaven ancamò ind l’ER dei cellule mudante sec31-1 dop l’incubazion a 37°C e pœ liberads a 24°C per 5 minuts (Figura 1). Del moment qe el Mid2-iRFP l’è distribuid su l’intera membrana ER, e el Gas1-GFP l’è concentrad e racolt ind l’area de la membrana ER discontinua, la soa distribuzion l’è completament diferenta (Figura 1, A a C e Film S1). Ancamò, cuma mustrà in de la figüra 1D, el grupp Gas1-GFP g’ha no Mid2-iRFP. Qei resultads qì indiqen qe i proteine ​​GPI-AP e trasmembrana inn staite separade a’l principi in diferents rejon de membrana ER. El grupp Gas1-GFP l’è visin a un ERES specifich etichettà cun la proteina del mantell COPII de mCherry Sec13 (Figura 1, E e F e film S1) (23).
I celùl sec31-1 esprimen secreziun induù del galattosio, una ceramida a cadena acil luungh (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verd) e la proteina trasmembrana Mid2-iRFP (TMP, blu) e chesta marcadura ERES costruttiva l’è stada magentada a Sec13-mCherry (Cherry30). minut, spustà a 24°C e imaginà de SCLIM 5 minut dopu. (A a C) mustra un imagen 2D rapresentatif fusa o singul de un plan (A), un imagen de proieziun 2D de 10 seziun z (B) o un imagen 3D del emisfero celùlar de cargo e marcadur ERES (C). Barra de scäla 1μm (A e B). L’unità de scäla l’è de 0,551μm (C). Gas1-GFP l’è stà rilevà en regiun o cluster ER discrét, menter el Mid2-iRFP l’è stà rilevà e distribuì en tüt la membrana ER (C). (D) El grafich mustra l’intensità relatif de fluorescenza de Gas1-GFP e Mid2-iRFP in del grupp Gas1-GFP luungh la linea de la freccia bianca (a sinistra). UA, unità arbitraria. (E e F) rapresentan l’imagin 3D che cumbina el beni e la marca ERES. I grupp Gas1-GFP sun stà rilevà visin al ERES specifich. L’unità de scäla l’è de 0,551μm. (F) La freccia solida bianca marca el cluster Gas1-GFP asocià a ERES. I panei median e a destra mustran l’imagin 3D ingrandì fusa e una vista rotada del cluster Gas1-GFP seleziunà.
La streita relazion spazial intra el cluster Gas1-GFP e un ERES specifeg l’indica qe el Gas1-GFP al pœl entrar ind l’ERES seletiv, qe l’è diferent de la seletivitaa drovada del Mid2-iRFP per lassar l’ER. Per afruntar chesta pusibilità, g’hem quantificà el raport ERES per sultant un o dü beni (Figura 2, A a C). G’hem descuvert che la magiur part di ERES (70%) g’ha sultant un tip de cargo. L’imagen in bas de la figüra 2C mustra dü esempi tipich de ERES cun sultant Gas1-GFP (figüra 1) o sultant Mid2-iRFP (figüra 2). Al cuntrari, circa el 20% del ERES g’ha denter dü carich che se soraponden in de la stess area. L’è stà descuvert che quai ERES (10%) g’haveva denter dü tip de cargo, ma l’eran isulà en aree chiarament diferent. Donca, chesta analìs statistich mustra che dopu che l’ER l’è esportà, el GPI-AP Gas1-GFP e el carg trasmembran Mid2-iRFP sun dividù en ERES diferent (Figura 2D). Chesta eficienza de urdinament l’è parècc coerent cun la precedent analìs biochimich (6) e la determinaziun morfologich (7). Pœden anca osservar el cumpurtament del cargo en quarantena che entra en ERES (Figura 2E e Film S2). La figura 2E la mostra che sultant una part piscinina de Gas1-GFP (panel 3) o Mid2-iRFP (panel 4) entra in del ERES de un lat e l’è cunfinada en un’area discreta. El panell 5 de la figura 2E al mostra qe el Gas1-GFP e el Mid2-iRFP dei vœlte se trœven ind l'istess ERES, ma i vann denter de lats diferents e inn concentrads in rejon separade qe pœden rapresentar vesicole COPII diferente. A’l g’hem anca confermad qe la separazion e la classifegazion osservada del GPI-AP Gas1 basad su la ceramida C26 comè ERES seletiv l’è specifega perqè un olter carg de secrezion trasmembrana, la proteina de la membrana plasmatega marcada cont GFP Axl2 (27 ), qe la mostra un comportament simil a’l Mid2-iRFP. (Immagin S1 e Film S3). L'Axl2-GFP nœvament sintetizad l'è distribuid a travers la membrana ER comè el Mid2-iRFP (Figura S1, A e B), e l'è co-localizad cont el Mid2-iRFP ind la major part dei ERES (Figura S1, B a D). I panei 1 e 2 de la figüra 1. S1C mustra dü esempi tipich de ERES induè dü carich trasmembran se soraponden. En chesti cas, tüt i dü i beni entran insema en ERES (Figura S1E, Panel 3 e Film S3).
I celùl sec31-1 che esprimen secreziun inducibil al galattosio, Gas1-GFP (GPI-AP, verd) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e l’etichettadüra ERES costitutiva Sec13-mCherry (ERES, magenta) sun stà mettuu a 37 Dopu l’incubaziun a °C a 30 minut. blocch, e imagen cun SCLIM dopu 20 minut. (A a C) Imagen de proieziun 2D rapresentatif (A; barra de scäla, 1μm) o imagen de emisfero celùlar 3D (B e C; unità de scäla, 0,456μm) del cargo e 10 seziun z segnà de ERES. El panei inferiur en (B) e el panei en (C) mustran imagen elaborà per visualizar sultant i beni present en ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) e Mid2-iRFP (blu ciair)]. (C) Freccia averta: ERES trasporta sultant un pezz de cargo (da 1 a 4). Freccia grigia: ERES g’ha denter cargo segregà (5). Freccia solida bianca: ERES che g’ha denter un cargo co-localizà. Sotta: el singol ERES selezionad al contegn domà Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra de scäla, 100 nm. (D) Quantificaziun del fotomicrograf descrivuu en (C). La percentual media de ERES che g’ha denter sultant un carich (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), carich segregà e carich sorapost. En tri esperiment indipendent, n=432 en 54 celùl. Barra d’erur = SD. Test t minga accuppià a dü cu. *** P = 0,0002. (E) Imagen 3D de ERES seleziunà de cargo en quarantena segnà cun (C). Gas1-GFP (verd) (3) o Mid2-iRFP (blu) (4) entra ind l’ERES (magenta) de un lat e l’è limitad a una zona picinina denter de l’ERES. Quai volt, tüt i dü tip de cargo entran in del stess ERES (5) del stess lat e sun cunfinà en un’area isulada denter del ERES. Barra de scäla, 100 nm.
Sucessivament, g’hem testà un’ipotès che la ceramida a cadena acil luungh (C26) present in de la membrana ER guida el raggruppament e la urdinament specifich de Gas1 en ERES seletif. A tal fin, hem drovad un cep de levad modifegad GhLag1, indov qe i duu sintasi ceramide endojene Lag1 e Lac1 inn staite sostituide de GhLag1 (l'omolog Lag1 del coton), col resultar de un cep de levad cont un cep de ceramida de membrana cellular plussee curt del tip selvateg (Figura 3A) (2). L'analisi de la spettrometria de massa (MS) l'ha mostrad qe ind i cep selvateg, el 95% de la ceramida total l'è una ceramida a cadena longa (C26), inscambi ind el GhLag1, l'85% de la ceramida l'è longa (C18 e C16). ), sultant el 2% de la ceramida l’è ceramida a cadena luungh (C26). Anca se i ceramide C18 e C16 inn i ceramide principai rilevade ind la membrana GhLag1 fina adess, l'analisi MS l'ha anca confermad qe l'ancora GPI de Gas1-GFP espressa ind el cep GhLag1 al contegn la ceramida C26, qe l'è comparabel ai lipids de tipolojia selvatega. La qualità l’è istess (Fig. 3A) (26). Donca, quest al segnifega qe l'enzima de rimodellazion de la ceramida Cwh43 l'è estremament seletiv per la ceramida C26, comè mostrad ind la figura 26, al incorpora preferenzialment l'ancora GPI de una quantitaa picinina de ceramida C26 ind el cep GhLag1. S2 (29). Comesessia, la membrana cellulara de GhLag1 la contegn fondamentalment domà la ceramida C18-C16, inscambi el Gas1-GFP al g’ha ancamò la ceramida C26. Qell fait qì al rend qell cep qì un strument ideal per resolver specifegament el problema de la longeza de la cadena acil de la ceramida de membrana ind l'ER. El ròll ipotétich de la class e de la classificaziun. Pœ, g’hem studiad prima l’abilitaa de C26 Gas1-GFP de accumular-s in grup in GhLag1 cont un allel mudant sensibil a la temperadura de sec31-1 a travers la microscopia a fluorescenza convenzional, indov qe domà la cadena longa (C18-C16) l’esist ind la ceramida de la membrana ER (Fig. 3). G’hem osservad che in del sec31-1, la magiur part del Gas1-GFP l’era cuncentrà en grupp, menter el Gas1-GFP in del sec31-1 GhLag1 cun la membrana ER de ceramida luungh (C18-C16) l’era principalment minga raggruppà e distribuì en in de la membrana ER intera. Per vesser precis, perqè el raggruppament basad su la ceramida C26 l’è streitament ligad a ERES specifeg (Figura 1), hem indagad sucessivament se qell process qì al pœl coinvoljer anca la fonzion del mecanism de proteina de esportazion ER. GPI-AP dupera un sistèm special COPII per l’esportaziun ER, che l’è regulà ativament del rimodellament strütüral de Ted1 de la porziun glican del ancora GPI (30, 31). El GPI-glican recombinant l'è pœ recognossud del compless p24 del recetor de carga trasmembrana, qe a soa vœlta al recluta seletivament Lst1, qe l'è un'isoforma specifega de la sotunitaa principal de ligament del carga COPII Sec24, qe la forma una vesicola COPII ricca de GPI-AP inn necessarie (33). Donca, hem costruid un dobi mudant qe l'ha combinad l'eliminazion de qei proteine ​​singole qì (el component compless p24 Emp24, l'enzima de rimodellazion del GPI-glican Ted1 e la sotunitaa specifega COPII Lst1) cont el cep mudant sec31-1, e i hem studiads L'è possibel formar GFP1-clu3). G’hem osservad qe ind la sec31-1emp24Δ e ind la sec31-1ted1Δ, el Gas1-GFP l’è principalment miga ragrupad e distribuid in tuta la membrana ER, comè vist in precedenza ind el sec31-1 GhLag1, inscambi ind el sec31-1lst1Δ, el Gas1-GFP1 Comè el sec3. Qei resultads qì indiqen qe, olter a la presenza de la ceramida C26 ind la membrana ER, l'agrupament de Gas1-GFP al g'ha anca de besogn de ligar-s al compless p24 e al g'ha miga de besogn de un reclutament Lst1 specifeg. Pœ, hem esplorad la possibilitaa qe la longeza de la cadena de la ceramida ind la membrana ER la pœl regolar el ligam de Gas1-GFP a p24. Comesessia, hem descovert qe la presenza de la ceramida C18-C16 ind la membrana l’influiss miga sui GPI-glican recostruids del compless p24 (Figure S3 e S4, A e B) o sul legam a GPI-AP e l’esportazion de GPI-AP. abilitaa. Recluta el sottatip COPII Lst1 (Figura S4C). Donca, l'agrupament dipendent de la ceramida C26 al necessita no de interazion proteige cont divers mecanism de esportazion proteiga ER, ma al sostegn un mecanism de classificazion alternativ guidad de la longeza dei lipids. Pœu, g’hem analizà se la luungheza de la cadena acil ceramida in de la membrana ER l’è impurtant per la classifegaziun eficas de Gas1-GFP cuma ERES seletif. Dejà qe el Gas1 ind el cep GhLag1 cont la ceramida a cadena curta al lassa l'ER e al va denter ind la membrana plasmatega (Figura S5), credom qe se la classificazion l'è guidada de la longeza de la cadena acil de la ceramida, el Gas1 ind el cep GhLag1 al pœl vesser redirezionad e incroxiad. Beni ERES cun l’istess membrana.
(A) La membrana cellular de GhLag1 la contegn principalment ceramide C18-C16 plussee curte, inscambi l'ancora GPI de Gas1-GFP la g’ha ancamò l'istess IPC C26 dei cellule selvateg. Sora: analisi de la luungheza de la cadena acil de la ceramida ind la membrana cellulara de cep selvateg (Wt) e GhLag1p per spettrometria de massa (MS). I dati rapresentan la percentual de ceramida total. La media di tri esperiment indipendent. Barra d’erur = SD. Test t minga accuppià a dü cu. **** P <0,0001. Panel in bas: analisi MS de la luungheza de la cadena acil del IPC present in del ancora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) espress in di cep selvadegh e GhLag1p. I dati rapresentan la percentual del segnal IPC total. Media de ciinch esperiment indipendent. Barra d’erur = SD. Test t minga accuppià a dü cu. ns, minga impurtant. P = 0,9134. (B) I micrograf de fluorescenza di celùl che esprimen Gas1-GFP induu del galattosio sun stà incubà a 37°C e a una furma de passagg a 37°C per un minut de passagg. dopu 24°C. Freccia bianca: grupp ER Gas1-GFP. Freccia averta: el Gas1-GFP minga raggruppà l’è distribuì sü l’intera membrana ER, mustrand la coloraziun carateristich del anel nuclear ER. Barra de scäla, 5μm. (C) Quantificaziun del fotomicrograf descrivuu en (B). La percentual media de cellule cont la strutura puntuada Gas1-GFP. En tri esperiment indipendent, n≥300 celùl. Barra d’erur = SD. Test t minga accuppià a dü cu. **** P <0,0001.
Per resolver diretament qell problema qì, hem fait la visualizazion SCLIM de Gas1-GFP e Mid2-iRFP in GhLag1 cont l'allel mudant sensibil a la temperadura sec31-1 (Figura 4 e Film S4). Dopu che l’ER l’è stà mantegnuu a 37°C e dopu liberà a 24°C, la magiur part del Gas1-GFP nöf sintetizà l’è minga stà raggruppà e distribuì en tüt la membrana ER, cuma osservà di microscopi cunvenziunai (Figura 4, A e B). Ancamò, una grand percentual de ERES (67%) cumprend dü tip de cargo co-locà denter (Figura 4D). I panei 1 e 2 de la figura 4C mostren duu esempi tipeg de ERES cont Gas1-GFP e Mid2-GFP soraposts. Ancamò, tüt i dü beni sun stà reclutà in del stess ERES (Figura 4E, panell 3 e film S4). Donca, i noster resultads indiqen qe la longeza de la cadena acil de la ceramida ind la membrana ER l’è un determinant important de l'agregazion e de la classifegazion dei proteine ​​ER.
I celùl GhLag1 Sec31-1 che esprimen secreziun induù del galattosio, Gas1-GFP (GPI-AP, verd) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e Sec13-mCeliza costitutif marcada cun ERES (ERES, magenta) se incuban a 37°C. Segutar per 30 minut, sbassar a 24°C per liberar i secreziun e imagen cun SCLIM dopu 20 minut. (A a C) Imagen de proieziun 2D rapresentatif (A; barra de scäla, 1μm) o imagen de emisfero celùlar 3D (B e C; unità de scäla, 0,45μm) di 10 seziun z segnà de cargo e ERES. El panei inferiur en (B) e el panei en (C) mustran imagen elaborà per visualizar sultant i beni present en ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) e Mid2-iRFP (blu ciair)]. (C) Freccia bianca riempida: ERES, beni se soraponden. Freccia averta: ERES g’ha denter sultant un element. Panel inferiur: l’ERES seleziunà g’ha di beni sorapost (1 e 2) segnà en (C). Barra de scäla, 100 nm. (D) Quantificaziun del fotomicrograf descrivuu en (C). In di unità GhLag1 sec31-1 e sec31-1, l’è inclus sultant un carich (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) e la percentual media de ERES per carich isulà e carich sorapost. En tri esperiment indipendent, n = 432 en 54 celùl (sec31-1) e n = 430 en 47 celùl (sec31-1 GhLag1). Barra d’erur = SD. Test t minga accuppià a dü cu. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imagen 3D de ERES seleziunà cun cargo sorapost (3) segnà en (C). El Gas1-GFP (verd) e el Mid2-iRFP (blu) se avvicinan a l’ERES (magenta) de l’istess lat e restan in de l’istess area ristretta del ERES. Barra de scäla, 100 nm.
Qell studi qì al forniss prœve direte in vivo qe i carg proteig basads sui lipids inn classifegads in sits de esportazion seletiv ind la via secretoria, e al rivela l'importanza de la longeza de la cadena acil per la seletivitaa de classifegazion. Duperant una tecnich de microscopia putent e d’avanguardia ciamada SCLIM, g’hem dimustrà el Gas1-GFP sintetizà aprœuf (una membrana plasmategh impurtant GPI-AP cunt una porziun lipidich de ceramida a cadena acil (C26) luungh) en lievit ) I regiun raggruppà en protein ER specifich discrét sun asocià a travers ES. la membrana ER (Figura 1). Ancamò, chesti dü tip de beni entran seletivament en ERES diferent (Figura 2). La longeza de la cadena acil de la ceramida cellular ind la membrana l’è redota de C26 a C18-C16, el cluster Gas1-GFP l’è desgregad ind la rejon ER discreta e el Gas1-GFP l’è ridirigiad per lassar l'ER cont la proteina trasmembrana a travers l'istess ERES (Figura 3 e Figura 3). 4).
Anca se el GPI-AP al drova un mecanism proteig specializad per sortir de l'ER, hem descovert qe la separazion dipendenta de la ceramida C26 la se basa no sui interazion proteige diferenziai qe pœden portar a la specializazion ERES (Figure S4 e S5). Inveci, i noster descoverte sostegnen un mecanism de classifegazion alternativ guidad del raggrupament dei proteine ​​basads sui lipids e de la sucessiva esclusion de oltr carg. I noster osservazion indiqen qe la rejon o el cluster Gas1-GFP associad a un ERES specifeg al manca la proteina secernida de la trasmembrana Mid2-iRFP, qe l’indica qe el cluster GPI-AP dipendent de la ceramida C26 al facilitarà la soa entrada ind el ERES rilevant, e al medem temp, al esclud qella secrezion particolar qì 2). Al contrari, la presenza de ceramide C18-C16 ind la membrana ER la fa miga far formar rejon o cluster del GPI-AP, donca i escluden o sostituissen miga i proteine ​​secernide a trasmembrana ind l'istess ERES (Figure 3 e 4). . Donca, proponn qe la ceramida C26 la guida la separazion e la classifegazion facilitand l'agrupament de proteine ​​ligade a ERES specifeg.
Cuma ottegnir chestu raggruppament dipendent de la ceramida C26 en una specifich area ER? La tendenza de la ceramida de membrana a separar-s lateralment la pœl far in manera qe la ceramida GPI-AP e C26 la forma de lipids picinen e ordenads istantaneament ind l'ambient lipideg plussee iregolar de la membrana ER qe la contegn glicerolipids plussee curts e insaturads. Grupp de qualità (17, 18). Qei cluster temporane picinin qì pœden vesser ulteriorment funduds in cluster plussee grands e stabei dop de vesser ligade al compless p24 (34). Coerent cun chestu, g’hem mustrà che C26 Gas1-GFP g’ha bisogn de interagir cunt el cumpless p24 per furmar cluster visibil püsee grand (Figura 3). El compless p24 l’è un oligomer eterozigota componud de quatr proteine ​​trasmembrane p24 diferente ind el levad (35), qe al forniss un legam multivalent, qe al pœl portar a un ligam incroxiad de grup picinen GPI-AP, jenerand insì un grup stabel plussee grand (34). L'interazion intra i ectodomini proteig dei GPI-AP la pœl anca contribuir a la soa agregazion, comè mostrad durant el so trasport del Golgi ind i cellule epitelial polarizade dei mamifer (36). Comesessia, quand qe la ceramida C18-C16 l’è present ind la membrana ER, quand qe el compless p24 al se lega a Gas1-GFP, se formaran no grands cluster separads. El mecanism sotastant al pœl dipender dei proprietaa fisege e qimege specifege de la ceramida a cadena acil longa. I stüdi biofisich di membran artificiai mostran che anca se i ceramid a cadena acil luungh (C24) e cuurt (C18-C16) pœden causar la separaziun di fas, sultant i ceramid a cadena acil luungh (C24) pœden favorir una volta curvadüra e la flessiun del film per rifurmar el film. Travers del riferiment reciproch (17, 37, 38). L’è stait demostrad qe l'elica trasmembrana de TMED2, l'omolog uman de Emp24, l'interajiss seletivament cont la sfingomielina basada su la ceramida C18 ind i lobul citoplasmeg (39). Duperant i simulaziun de dinamich molecùlar (MD), g’hem descuvert che sia i ceramid C18 che C26 se accumulan intorna ai lobul citoplasmich del elica trasmembrana Emp24 e g’han di preferenz simil (Figura S6). Vale la pena notar qe quest l’indica qe l'elica trasmembrana de Emp24 la pœl portar a una distribuzion asimetrega dei lipids ind la membrana. Chestu l’è un resultà recent basà süi celùl di mamifer. Simulaziun MD simil mustran anca la presenza di lipid eterich (40) . Donca, speculem qe la ceramida C26 ind i duu lobul de ER26 l’è localment arriqida. Quand qe el GPI-AP ind i lobul luminai al se lega diretament a’l p24 multivalent e a l’accumulazion de la ceramida C26 intorn a’l p24 ind i lobul citoplasmeg, al pœl favorir l’agregazion proteiga compagna e la curvadura de la membrana qe inn jenerade a travers i dids (41), col far in manera qe el GPI-AP al se separa in manera volta ind la rejon discreta. regiun de la membrana ER (42). I raport precedent g’han suportà el mecanism propost (43, 44). El ligam multivalents dei oligoletine, dei patojen o dei anticorp ai glicosfingolipids basads su la ceramida (GSL) su la membrana plasmatega al scatena una granda agregazion GSL, l’aumenta la separazion de fas e al causa la deformazion e l’internalizazion de la membrana (44). Iwabuchi ecc. (43) L’è stait descovert qe in presenza de cadene acile longhe (C24) ma miga curte (C16), el ligand multivalent ligad a la lattosilceramida GSL l’ha induid la formazion de grands grup e l’invaginazion de la membrana, e la trasduzion del segnal mediada del citoplasma Lyn ind i fogliets de cagitropil l’è inter-acil.
Ind i cellule epitelial polarizade dei mamifer, la concentrazion de la red anti-Golgi (TGN) a’l nivell de la membrana plasmatega apical la controlla la separazion e la classificazion del GPI-AP (10, 45). Chesta agregaziun l’è guidada del oligomerizaziun GPI-AP (36), ma la pœu anca dipender de la luungheza de la cadena de ceramida che truvam in del lievit. Anca se el GPI-AP dei mamifer al g’ha un’ancora basada sui lipids eter, e la soa strutura qimega l’è tant diferenta de la ceramida a cadena acil longa, un studi recent l’ha descovert qe tuts duu i lipids g’hann proprietaa e fonzion evolutivament simil fisege e qimege (40). Donca, la part lipidega eter ind i cellule dei mamifer la pœl vesser simil a la ceramida C26 ind i levads, e el so rœl l’è quell de associar-s cont la ceramida a cadena longa ind la membrana per favorir l'agregazion e la classificazion GPI-AP. Anca se qella possibilitaa qì la g’ha ancamò de vesser testada diretament, i resultads precedents sostegnen qe el trasport de la ceramida a cadena acil longa al corp del Golgi l’è miga fait de proteine ​​de trasferiment citoplasmeg, ma al dipend de la sintesi de ancre GPI comè el levad. Donca, el mecanism conservador evolutiv al par vesser bon de co-trasportar seletivament la ceramida a cadena acil longa fiss e la GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ind l'istessa vesicola de trasport.
Ind i sistema cellular epitelial polarizads dei levads e dei mamifer, l'agregazion e la separazion GPI-AP dei oltre proteine ​​de la membrana plasmatega se verifegen tute inanz de rivar a la superfix cellulara. Paladino e al. (48) g’ha descuvert che sül TGN di celùl epitelial polarizà di mamifer, l’aggruppament GPI-AP l’è minga sultant necessari per la clasificaziun seletiva di GPI-AP a la membrana plasmategh apical, ma el regola anca l’organizaziun de raggruppament di GPI-AP e la sò atività biologich. Superficie de la cellula. In del lievit, chestu stüdi g’ha mustrà che el grupp GPI-AP dipendent de la ceramida C26 sül ER pœu regular l’organizaziun del grupp e l’atività funziunal del GPI-AP sü la membrana plasmatich (24, 49). Coerent cont qell modell qì, i cellule GhLag1 inn allergege ai inibidor GPI o ai medexine qe influenzen l'integritaa de la pared cellulara (28), e la necessitaa de cluster fonzionai Gas1-GFP (49) de la ceramida de ponta proietada ind l'acopiament dei cellule de levad l'indica G Possibei conseguenze fisiolojege de hLag1. Errur GPI-AP. Però, olter test se l’organizaziun funziunal de la superfiss celùlar l’è stada prugramada del ER cunt un metud de urdinament basà sü la luungheza di lipid sarà uget de la noster ricerca futura.
I cep de Saccaromice cerevisiae drovads in qell lavorar qì inn elencads ind la Tabella S1. I cep MMY1583 e MMY1635 de SCLIM per l'imajing cellular viva inn staits costruids sul fond de W303. Chesti cep che esprimen Sec13-mCherry cunt un etichett proteich fluoresent sun stà costruì duperand un metud basà sü la reaziun a cadena de la polimerasi (PCR) cunt el plasmid pFA6a cuma schéma (23). El cep qe l'esprim Mid2-iRFP marcad cont una proteina fluoressenta sota el controll del promodor GAL1 l'è stait costruid comè segue. Amplificaziun PCR de la sequenza iRFP-KanMx dal vetur pKTiRFP-KAN (don de E. O'Shea, plasmid addgen nümer 64687; identificatur de risurs de ricerca (RRID): addgen_server-endogen in Dopu che la sequenza del genoma Mid2-iRFP l’è stada amplificada e clùnada in del promotur GAL1, l’è stada integrada in del sit Not I-Sac I del plasmid de integraziun pRS306. El plasmid risultant pRGS7 l’è stait linearizad cont Pst I per integrar-s ind el locus URA3.
El jen de fusion Gas1-GFP l'è espress sota el controll del promodor GAL1 ind el plasmid del centromer (CEN), qe l'è costruid comè segue. La sequenza Gas1-GFP l’è stada amplificada travers PCR dal plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (don de L. Popolo) e clùnada in del sit Xma I-Xho I del plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (don de C). Miller; Numer del plasmid adjen 51225; 51225; RRID: Aggiunta_51225). El plasmid resultant l'è stait ciamad pRGS6. El jen de fusion Axl2-GFP l'è anca espress sota el controll del promodor GAL1 del vetor LEU2 pBEVY-GL, e la soa costruzion l'è la seguenta. La sequenza Axl2-GFP l’è stada amplificada del plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) travers PCR e clùnada in del sit Bam HI-Pst I del vetur LEU2 pBEVY-GL. El plasmid risultant l'è stait ciamad pRGS12. La sequenza dei oligonucleotids drovads in qell studi qì l’è elencada ind la Tabella S2.
El cep l’è stait integrad cont el 0,2% de adenina e el 2% de glucosi [YP-destrosa (YPD)], el 2% de rafinosa [YP-rafinosa] ricc de estrat de levad proteina p (YP) (1 % de estrat de levad e 2% de proteina ept). (YPR)] o 2% de galattosio [YP-galatosio (YPG)] cuma funt de carbonio, o en un mez minim sintetich (0,15% de bas de azot de lievit e 0,5% de sulfat de amonio) per integrar i aminoacid e bas aproprià duperà per la nutriziun, e che g’ha denter el 2% de glucosio sintetich o glucosio2 minim (mez minim de galatosi sinteteg) comè font de carboni.
Per l'imajen in temp real, i cellule mudante sec31-1 sensibil a la temperadura qe esprimen el costruit sota el promodor GAL1 inn staite coltivade ind un mez YPR a 24°C durant la noit a la fas mid-log. Dopu l’induziun en YPG a 24°C per 1 ura, i celùl sun stà incubà en SG a 37°C per 30 minut e dopu trasferii a 24°C per liberar del blocch de secreziun. La concanavalina A l’è stada duperada per fissà i celùl sü una vetrina de veder e imaginà de SCLIM. SCLIM l’è una cumbinaziun de miscoscopi a fluorescenza invertida Olympus IX-71 e lent a oli cun apertura numerich UPlanSApo 100 × 1,4 (Olympus), scanner cunfucal a disc rotant a volta velocità e volt raport segnal-rumòr, spettrometer cunfucal a disc rotant (Yokogawa Electric e personalizà). (Fotonica Hamamatsu) pœu furnir un sistèm de lent de ingrandiment cunt un ingrandiment final de ×266,7 e una videocamera accuppiada a carica che multiplica i eletrun (Fotonica Hamamatsu) (21). L’acquisiziun di imagen l’è fatt de un prugrama personalizà (Yokogawa Elettric). Per i imagen 3D, duperam un atuatur piezoeletrich su mesüra per vibrar la lent ubietiva en vertical e cattà sü i part ottich a distanza de 100 nm en una pila. L’imagen de la pila Z l’è cunvertida en dati voxel 3D e la funziun teorich de diffusiun di puunt duperada per el miscoscopi cunfucal a disc rotant l’è duperada per l’elaboraziun de la deconvoluziun dal software Volocity (PerkinElmer). Duperant el software Volocity per limitar automaticamente l’analìs de co-posiziunament, l’è stà misurà l’ERES, anca el cargo. L’analìs de scansiun linear l’è stada fada duperand el prugrama MetaMorph (Dispositif molecùlari).
Dupera el prugrama GraphPad Prism per determinar el significà statistich. Per el test t de Student a dü cu e el test urdinari de analìs unidireziunal de varianza (ANOVA), se pensa che i diferenzi intra i grupp g’han un impatt significatif sü P <0,05 (*).
Per la microscopia a fluorescenza de Gas1-GFP, i celùl de fas log sun stà cressü durant la nott in YPD e cattà sü per centrifugaziun, lavaa dü volt cun salina tamponada cun fosfat e incubà sü giasc per almenu 15 minut, e dopu procedüu sotta el miscoscopi cuma descrivuu prima (Check24). Per l’acquisiziun l’è stà duperà el miscoscopi Leica DMi8 (olio HCX PL APO 1003/1,40 PH3 CS) dotà de un lent ubietif, de un filter L5 (GFP), de una fotocamera Hamamatsu e de un prugrama Application Suite X (LAS X). .
I campiun sun stà denaturà cun tampon campiun SDS a 65°C per 10 minut e dopu separà cun eletroforesi sü gel de poliacrilamida SDS (PAGE). Per l’analìs de imunotransferiment, sun stà caricà 10 μl de campiun per corsia. Anticorp primari: dupera l'anti-Gas1 policlonal de lapin a una diluiziun de 1:3000, l'anti-Emp24 policlonal de lapin a una diluiziun de 1:500 e l'anti-GFP policlonal de lapin (un regal de H. Riezman) a una diluiziun de 1:300. L'anticorp monoclonal anti-Pgk1 del rat l'è stait drovad a una diluizion de 1:5000 (un regal de J. de la Cruz). Anticorp segondari: imunoglobulina G (IgG) de cavra anti-lapin coniugada perossidasi del ravanell (HRP) duperada a una diluiziun de 1:3000 (Pierce). L’IgG anti-rat de cavra coniugada a HRP l’è stada duperada a una diluiziun de 1:3000 (Pierce). La zòna de rispòsta imunitari l’è stada osservà cunt el metud de chimiluminescenza del reagent SuperSignal West Pico (Scientific Thermo Fisher).
Comè descrivuu en (31), l’è stà fatt un esperiment de imunoprecipitaziun natüral sü la fraziun ER arricchida. En curt, lavar i celùl de lievit cun tampon TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonil 1 mM e mistura inibitur de proteasi) a 600 nm (OD600 desintich) a 100 ottich. L’è stà rutt cun di perlin de veder e dopu i detriti celùlar e i perlin de veder sun stà cavà via cun la centrifugaziun. El suranatant l’è stà pœu centrifugà a 17.000 g per 15 minut a 4°C. El pellet l’è stà risuspendü en TNE e la saponina digitalis l’è stada giuntà a una cuncentraziun final del 1%. La suspensiun l’è stada incubada per 1 ura cun rotaziun a 4°C e dopu i compunent insolubil sun stà eliminà cun centrifugaziun a 13.000 g a 4°C per 60 minut. Per l’imunoprecipitaziun Gas1-GFP, prima preincuba el campiun cun perlin de agarosa vœui (ChromoTek) a 4°C per 1 ura e dopu incuba cun GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C per 3 ur. I perlin imunoprecipità sun stà lavà ciinch volt cun TNE che g’ha denter el 0,2% de digossigenina, eluì cun tampon campiun SDS, separà sü SDS-PAGE e analizà cun imunotransferiment.
Comè descrivuu in (31), la determinaziun del ligam incrocià l’è stada fada sü la fraziun ER arricchida. In curt, la fraziun ER arricchida l’è stada incubada cun 0,5 mM ditiobis (propionà de succinimidil) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Stat Ünì; 20°C, 20 min). La reaziun de reticulaziun l’è stada smorzada cun l’agiunta de glicina (cuncentraziun final de 50 mM, 5 minut, 20°C).
Comè descrivud in precedenza (50), l’è staita faita l’analisi MS de la ceramida in cep selvateg e GhLag1. En curt, i celùl sun stà cressü en fas espunenzial (da 3 a 4 unità OD600/ml) en YPD a 30°C e sun stà recüperà 25×107 celùl. El so metabolism al se smorza cont l'acid tricloroaceteg. Duperà solvent de estraziun [etanol, aqua, eter, piridina e idrossid de amonio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol de ceramida C17 standard interna (860517, lipid polar Avanti) de qualità). Duperà el reagent de monometilamina [metanol, aqua, n-butanol e soluziun de metilamina (4:3:1:5 v/v)] per fär una ligera idrolisi alcalina del estratt e dopu duperà n-butanol saturà en aqua per desalar. Finalment, l’estratt l’è stà risuspendü en un solvent en mod pusitif [cloroform/metanol/aqua (2:7:1) + acetà de amonio 5 mM] e siringà in del spettrometer de mass. El monitoragg a multi-reaziun (MRM) l’è stà fatt per l’identificaziun e la quantificaziun di molecul de sfingolipid. El spettrometer de mass quadrupol terziari TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) l’è dotà de una surgent ionich robotich a nanofluss Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) per l’analìs di lipid. L’energia de sconter l’è otimizada per ogni categuria de ceramida. I dati MS sun stà ottegnuu en modalità pusitif. Per ogni replica biolojega, el segnal lipideg l’è la mediana de tre misurazion indipendente.
Comè descrivuu in (31), i celùl (800 × 107) che esprimen Gas1-GFP sun stà sottapost a imunoprecipitaziun natüral. El Gas1-GFP purificà l’è stà separà de SDS-PAGE e trasferì a una membrana de fluoruro de poliviniliden (PVDF). La proteina l’è stada visualizada colorand el PVDF cun amida neger. La banda Gas1-GFP l’è stada tajada del PVDF e lavada 5 volt cun metanol e una volta cun aqua de qualità cromatografia liquid-MS (LC-MS). Incuband la striscia de membrana cun 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampon e 500 μl de mescüla de nitrit de sodi 1 M dissolt a 37°C per 3 our, la fraziun lipidich l’è liberada de Gas1-GFP e Liberaziun de cercosamina lisida (51). Dopu, la striscia de membrana l’è stada lavada quater volt cun aqua de qualità LC-MS, seccada a temperadüra ambient e cunservà en un atmosfera de azot a -80°C fin a l’analìs. Cuma cuntrol, l’è stà duperà un campiun en bianch de membrana PVDF per ogni esperiment. El lipid estratt de Gas1-GFP l’è stà pœu analizà de MS cuma descrivuu (50). En curt, i strisce de PVDF che g’han denter lipidi GPI sun stà risuspendü en 75 μl de solvent de mudel negatif [cloroform/metanol (1:2) + acetà de amonio 5 mM] e sun passà l’analìs de ionizaziun eletrospray (ESI)-MRM/MS di spècc de sfingolipid (TSQ Vantage). En chestu cas, i dati MS sun stà ottegnuu en modalità ion negatif.
Comè dit prima, la porziun lipidich del ancora GPI l’è stada separada del GPI-AP marcad cun [3H]-inositol (16). I lipid sun stà separà cun cromatografia a strat sottil duperand un sistèm de solvent (55:45:10 cloroform-metanol-0,25% KCl) e visualizà duperand FLA-7000 (Fujifilm).
I celùl che esprimen Gas1-GFP (600×107) sun stà lavà dü volt cun tampon TNE cun tampon TNE, e rutt cun perlin de veder, e dopu centrifugà per scancelà i detriti celùlar e i perlin de veder. El süpernatant l’è stà pœu centrifugà a 17.000 g per 1 ura a 4°C. El pellet l’è stà lavà en TNE e incubà cun 1 U PI-PLC (Invitrogen) en TNE che g’ha denter el 0,2% de saponina digitalis per 1 ura a 37°C. Dopu el tratament enzimatich, la membrana l’è stada scancelada per centrifugaziun a 17.000 g a 4°C per 1 ura. Per imunoprecipitar Gas1-GFP, el suranatant l’è stà incubà cun GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C durant la nott. El Gas1-GFP purificà separà de SDS-PAGE l’è stà culurà cun blu brillant de Coomassie. La banda de coloraziun Gas1-GFP l’è stada tajada del gris che circondava l’aquedott e dopu dopu l’alchilaziun cun iodoacetamida e la reduziun cun ditiotreitol, l’è stada fada la digestion en gel cun tripsina. Estrar e secar peptids triteg e peptids cont GPI-glican. El peptid secc l’è stà dissolt en 20 μl de aqua. Inietar una porziun (8μl) in del LC. Una culonn de otadecilsilan (ODS) l’è stada duperada per separar i peptidi en cundiziun de gradient specifich. La fas mobil l’è el solvent A (0,08% acid formich) e el solvent B (0,15% acid formich en 80% acetonitril). Un sistèm HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) l’è stà duperà per eluir la culona cunt el solvent A en 55 minut a un fluss de 50 μl min-1 per 5 minut e dopu la cuncentraziun del solvent B l’è stada aumentada al 40%. , Stat Ünì). L’eluà l’è stà introdott continuamente in de la funt ionich ESI e i peptidi trittich e i peptidi cun glican GPI sun stà analizà de LTQ Orbitrap XL (spettrometer de mass linear ibrid trap-orbitrap de ion; Thermo Fisher Scientific). In de la configuraziun MS, la tensiun de la surgent capilar l’è stada impostada a 4,5 kV e la temperadüra del capillar de trasferiment l’è stada mantegnuda a 300°C. La tensiun capilar e la tensiun de la lent del tub sun stà fissà rispettivament sü 15 V e 50 V. I dati MS sun stà ottegnuu en modalità ion pusitif (risoluziun de 60.000; precisiun de mass de 10 part per miliun) en un interval de mass de 300/m/z raport masa/carica (m/z) 3000. I dati MS/MS sun ottegnuu travers de la trappola ionica in del LTLQ dissociaziun induuda de la sconter (CID)].
I simulaziun MD sun stà fatt duperand el prugrama GROMACS (52) e el camp de forza MARTINI 2 (53-55). El costrutur de membran GUI CHARMM (56, 57) l’è stà duperà per costruir un bilivell che g’ha denter dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e Cer C18 o DOPC e Cer C26. La topologia e i coordinà de Cer C26 sun derivà de DXCE scanceland i perlin extra de la cua de sfingosina. Dupera el prucess descrivuu disotta per bilancià el duppi strat e färlo funziunar, e dopu dupera i ültem coordinà del sistèm per costruir un sistèm che g’ha denter Emp24. El domini trasmembran del levad Emp24 (residu 173 a 193) l’è stait costruid comè un’elica α cont l’utilizar la strutura molecolar del strument MD visiv (VMD) (58). Pœ, dop de haver scancellad i lipids soraposts, la proteina l’è staita granulada grossament e inserida ind el bilivell cont l’utilizar la GUI CHARMM. El sistèm final g’ha denter 1202 DOPC e 302 C26 o 1197 DOPC e 295 C18 e Emp24. Ionizar el sistèm a una cuncentraziun de 0,150M. Quater copi indipendent sun stà fatt per dü composiziun a dü strati.
El bilivell lipidich l’è bilancià duperand el prucess GUI CHARMM, che cumporta la minimizzaziun e dopu el bilanciament de 405.000 pas, induè i vincul de posiziun sun gradualment redut e eliminà e el pas de temp l’è aumentà de 0,005 ps a 0,02 ps. Dopu l’equilibri, produss 6 μs cunt un pass de temp de 0,02 ps. Dopu l’inserziun de Emp24, dupera l’istess prucess GUI CHARMM per minimizà e bilancià el sistèm e dopu fär funziunar per 8 s en produziun.
Per tüt i sistèm, durant el prucess de bilanciament, la presiun l’è cuntrulada del barostat de Berendsen (59) e durant el prucess de produziun, la presiun l’è cuntrulada del barostat de Parrinello-Rahman (60). En tüt i cas, la presiun media l’è de 1 bar e se dupera un schèma de accoppi de presiun semiisotropich. In del prucess de bilanci e de produziun, un termostat (61) cun ricalibraziun de velocità l’è duperà per acoblà rispettivament la temperadüra di partisel de prutein, lipid e solvent. Durant l’inter funziunament, la temperadüra obietif l’è de 310K. L'interazion miga ligada l'è calcolada col jenerar una lista de acopiament cont el sqema de Verlet cont una toleranza tampon de 0,005. El termin de Coulomb l’è calculà duperand el camp de reaziun e una distanza de limit de 1,1 nm. El termin de Vander Waals dupera un schèma de limit cunt una distanza de limit de 1,1 nm e el schèma de limit de Verlet l’è duperà per la deriva putenzial (62).
Duperant la VMD, la luungheza d’unda de limit intra i perlin de fosfad DOPC o i perlin de ceramida AM1 e la proteina l’è de 0,7 nm e l’è calcolad el numer de lipids qe interajissen cont la proteina. Segond la formula seguent, calcula el fatur de esauriment-arricchiment (DE) cuma en (63): fatur DE = (la quantità de lipid total in de la proteina 0,7) in de la proteina 0,7 (la quantità de Cer in di lipid total)
El valur segnalà l’è ottegnuu cuma media e i bar d’erur sun quater copi indipendent de SE. La significà statistich del fatur DE l’è calculada cun la prœuva t [(media-fatur-DE-1)/SE]. Calcula el valur P de la distribuziun a una cua.
El strüment GROMACS l’è stà duperà per calculà la mapa de densità lateral 2D del sistèm che g’ha denter Emp24 denter di ültem 250 ns de la tracia. Per ottener la mapa de arricchiment/impoveriment de la ceramida, la mapa de densità de Cer l’è divisa per la suma de la mapa de Cer e DOPC, e dopu divisa per la cuncentraziun de Cer in del corp. L’è duperada l’istess scäla de la mapa di culur.
Per i materiai suplementar per chestu articul, varda
Chestu l’è un articul a acess avèrt distribuì ai termin de la licenz de attribuziun-minga cumercial Creative Commons, che cunsent l’üs, la distribuziun e la riproduziun en qual-sa-vöör mezz, purché l’üs final l’è minga per un guadagn cumercial e la premesa l’è che l’oper uriginal l’è giüst. Riferiment.
Nota: Ti dumandem sultant de furnir el tò indiriz e-mail inscì che la persuna che te racumandi a la pagina la sa che te vœut che la veda l’e-mail e che l’è minga spam. Catturem no nissun indiriz e-mail.
Chesta dumanda l’è duperada per verificar se l’è un visitant e per evitar l’invio automatich de spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L’imajen in temp real 3D a volta resoluzion la rivela l’importanza de la longeza de la cadena de la ceramida per la classificazion dei proteine ​​ind i sits de output seletiv.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L’imajen in temp real 3D a volta resoluzion la rivela l’importanza de la longeza de la cadena de la ceramida per la classificazion dei proteine ​​ind i sits de output seletiv.
©2020 Asociaziun americana per el prugress de la scienza. tutti i diritti riservati. AAAS l'è un partner de HINARI, AGORA, OARE, COR, CLOCKSS, Riferiment incrocià e CONTADOR. Avanzament de la Scienza ISSN 2375-2548.