Diferent teurì de la difesa di piant dan una guida teorich impurtant per spiegar i mudei de metabolism specializà di piant, ma luur previsiun ciave restan da verificà. Chichinscì, g’hem duperà l’analìs imparzial de la spettrometria de mass en tandem (MS/MS) per esplurar sistematicament el metabolom di cep atenuà del tabacch di singul piant a populaziun e spècc strècc ligà, e g’hem elaborà un grand nümer de teurì di carateristich spettrometrich de mass basà sü spettr cumpost in di informaziun. Quader per testar i previsiun ciave di teurì de la difesa ottimal (OD) e del obietif muviment (MT). El compunent informatif de la metabolomich di piant l’è coerent cun la teuria OD, ma cuntradis la previsiun principal de la teuria MT süi dinamich metabolomich causà di erbivor. De la scala evolutiva micro a la macro, el segnal jasmonad l’è stait identifegad comè determinant principal de l’OD, inscambi el segnal de etilene al forniva l’accordazion de la resposta specifega dei erbivor anotada de la red molecolar MS/MS.
I metabolit speciai cun strütür diferent sun i partecipant principal in del adatament di piant al ambient, en particular en difesa di nemìs (1). La incredibil diversificaziun del metabolism special che se truva en i piant g’ha stimulà desènn de prufunda ricerca süi sò tanti aspett di funziun ecologech e g’ha furmà un luungh elenc de teurì de la difesa di piant, che sun el svilupp evolutif e ecologich di interaziun piant-insètt. La ricerca empirica la da una guida importanta (2). Però, chesti teurì de la difesa vegetal g’han minga seguì el percors normatif del ipotétich ragiunament dedutif, induè i previsiun ciave l’eran a l’istess livel de analìs (3) e sun stà testà sperimentalment per fär avanzà el ciclo sucesif de svilupp teoretich (4). I limitazion tecnege limiten la regollida dei dats a categorie metabolege specifege e escluden l'analisi completa de metabolits specializads, e prevegnen insì i confront intra categorie qe inn essenziai per el desvilup teoreg (5). La mancanza de dati metabolomich cumplet e de una moneda comun per cunfruntar el fluss lavurà de la lavuraziun del spazi metabolich intra diferent grupp vegetai ostacula la maturità scientifich del camp.
I ultem desvilup ind el camp de la metabolomega de la spettrometria de masse in tandem (MS/MS) pœden caraterizar completament i cambiaments metaboleg denter e intra i spece de un cert clad de sistema, e pœden vesser combinads cont metods computazionai per calcolar la someianza strutural intra qei mes’ci complesse qì. Cognossenza precedent de la chimica (5). La combinazion de tecnolojie avanzade ind l'analisi e ind el computing la forniss una strutura necessaria per i prœve a longa scadenza de tante predizion faite dei teorie ecolojege e evolutive de la diversitaa metabolega. Shannon (6) g’ha mettuu dent la teuria del informaziun per la prima volta en sò articul fundamental in del 1948, mettend i bas per l’analìs matemategh di informaziun, che l’è stada duperada en tanti camp divers de la sò aplicaziun uriginal. En genomich, la teuria del informaziun l’è stada aplicada cun succès per quantificà i informaziun cunservatif di sequenz (7). Ind la recerca trascritomica, la teoria de l’informazion l’analiza i cambiaments complessiv ind el trascritoma (8). En la ricerca precedent, g’hem aplicà el quader statistich de la teuria del informaziun a la metabolomich per descrif la competenza metabolich del nivell tessütal en i piant (9). Chichinscì, cumbinam el fluss lavurà basà sü MS/MS cun la strütüra statistich de la teuria del informaziun, caraterizada de la diversità metabolich in de la moneda comun, per cunfruntar i previsiun ciave de la teuria de la difesa vegetal del metabolom induu di erbivor.
I quader teoretich de la difesa vegetal sun de solet a vicenda inclusif e pœden vèss dividù en dü categurì: quei che cercan de spiegar la distribuziun di metabolit specifich di piant basà süi funziun de difesa, cuma la difesa ottimal (DO) (10), l’ubietif mubil (MT) (11) ) e l’aspètt (12) de cuma cambian i mecanich. la dispunibilità influiss sü la cressita di piant e sü l’accumul de metabolit specializà, cuma el carbonio: ipotès del equilibri nutritif (13), ipotès del tass de cressita (14 ), e l’ipotès del equilibri de cressita e diferenziaziun (15). I dü insema de teurì sun a diferenti livei de analìs (4). Però, dü teurì che interesan i funziun de difesa a livel funziunal duminan la conversaziun süi difes costitutif e inducibil di piant: la teuria OD, che pensa che i piant investen en luur custus difes chimich sultant quand l’è necesari, par esempi, quand sun ingerì Quand un animal de erba ataca, donca, cun la pusibilità de funzion l’è asegnada (10); l'ipotesi MT la proponn qe la g'è no un ass de cambiament direzional del metabolit, ma el metabolit al cambia casualment, creand insì la possibilitaa Ostruir el "obietiv de moviment" metaboleg de atacar i erbivor. In oltre parolle, qei duu teorie qì fann predizion oposte sul rimodellament metaboleg qe al se verifega dop l'atac dei erbivor : la relazion intra l'accumulazion unidirezional de metabolits cont fonzion de difesa (OD) e i cambiaments metaboleg miga direts (MT) (11 ).
I ipotesi OD e MT coinvoljen miga domà i cambiaments induids ind el metaboloma, ma anca i conseguenze ecolojege e evolutive de l’accumulazion de qei metabolits qì, comè i costs e i benefici adativ de qei cambiaments metaboleg qì ind un ambient ecolojeg specifeg (16). Anca se tute e do i ipotesi recognossen la fonzion de difesa dei metabolits specializads, qe pœden o pœden miga vesser costos, la predizion fondamental qe la distingue i ipotesi OD e MT la sta ind la direzionalitaa dei cambiaments metaboleg induids. La previsiun de la teuria OD g’ha ricevuu l’atenziun püsee sperimental fin incœu. Chesti test cumprenden el stüdi di funziun de difesa dirett o indirett di diferent tessü de cumpost specifich en serr e en cundiziun natürai, e anca i cambiament in del stadi de svilupp di piant (17-19). De tute i manere, fina adess, a causa de la mancanza de un fluss de lavorar e de una strutura statistega per l'analisi global global de la diversitaa metabolega de qualsessia organism, la predizion principal de la diferenza intra i duu teorie (çoè la direzion dei cambiaments metaboleg) la resta de vesser verificada. Chichinscì, furnissem tal analìs.
Vuuna di carateristich püsee significatif di metabolit specifich di piant l’è luur estrema diversità strütüral a tüt i nivel di piant singul, populaziun a spècc simil (20). Tants cambiaments quantitativ ind i metabolits specializads pœden vesser osservads su la scala de la popolazion, inscambi dei forts diferenze qualitative se mantegnen jeneralment a nivell de speça (20). Donca, la diversità metabolich di piant l’è l’aspet principal de la diversità funziunal, rifletend l’adatabilità a diferenti nichi, en particular quei nichi cun pusibilità de invasiun diferent de part de insètt speciai e erbivor comun (21). Dal articul revoluziunari de Fraenkel (22) süi ragiun del esistenza di metabolit specifich di piant, i interaziun cun vari insètt sun stà cunsiderà cuma presiun de seleziun impurtant e se pensa che chesti interaziun g’han furmà i piant durant l’evoluziun. Via metabolega (23). I diferenzi interspeci in de la diversità di metabolit specializà pœden anca rifleter l’equilibri fisiologegh asocià a la difesa costitutiva e inducibil di piant cuntra i strategì erbivor, perché i dü spècc sun despess ligà en mod negatif intra luur (24). Anca se pœu vèss vantagg mantegnir una bona difesa en tüt i mument, i cambiament metabolich puntuai asocià a la difesa dan di benefis ciar en cunsentir ai piant de dedicar risurs prezius a olter investiment fisiologegh (19, 24), e evitar el bisogn de simbios. Danni colaterali (25). De soraplu, qei reorganizazion qì de metabolits specializads causads de inset erbivor pœden portar a una distribuzion distrutiva ind la popolazion (26), e pœden rifleter leture direte de cambiaments naturai sostanziai ind el segnal de l'acid jasmoneg (JA), qe pœden vesser mantegnuds ind la popolazion. I segnai JA volts e bass inn compromess intra la difesa contra i erbivor e la competizion cont spece specifege (27). De soraplu, i vie biosintetege dei metabolits specializads subiran una rapida perdita e una trasformazion durant l'evoluzion, cont el resultad de una distribuzion metabolega irregolar intra i spece streitament imparentade (28). Qei polimorfism qì pœden vesser stabilids rapidament in resposta ai cambiaments dei modei erbivor (29), qe al segnifega qe la fluttuazion dei comunitaa erbivor l’è un fator ciav qe guida l'eterojeneitaa metabolega.
Chichinscì, g’hem risolt i prublem che segutan. (I) Cuma l’insètt erbivor riconfigura el metabolom di piant? (Ii) Quai inn i components principai de informazion de la plastega metabolega qe pœden vesser quantifegads per testar i predizion de la teoria de la difesa a longa scadenza ? (Iii) Se riprogramar el metabolom vegetal en mod ünich per l’atacant, se l’è inscì, che ròl g’ha l’ormon vegetal in de la adataziun de una rispòsta metabolich specifich e che metabolit contribuisen a la specificità de la difesa de la spècc? (Iv) Dejà qe i predizion faite de tante teorie de la difesa pœden vesser estese a tuts i nivei de tessuds biolojeg, hem domandad quant qe la resposta metabolega causada l’è coerenta del confront intern a’l confront interspece? A chestu fin, g’hem stüdià sistematicament el metabolom di fœuj de la nicotina del tabacch, che l’è una pianta mudel ecologech cunt un rich metabolism specializà e l’è eficas cuntra i larv de dü erbivor natif, i lepidòtt datür (Ms) (parècc agresif, principalment mangià) süi tip de fœuj de lepidòtt). “gener”, cunt i piant ospit de Solanaceae e olter ospit de olter gener e famèji Aliment vegetal. G’hem analizà el spettru metabolomich MS/MS e g’hem estratt descritur statistich de la teuria del informaziun per cunfruntar i teurì OD e MT. Crear mape de specificitaa per rivelar l'identitaa dei metabolits ciav. L’analìs l’è stada estesa a la populaziun nativa de N. nasi e ai spècc de tabacch strècc ligà per analizar ulteriorment la covarianza intra la segnalaziun ormonai vegetai e l’induziun OD.
Per cattar una mapa cumplesiva sü la plasticità e la strütüra del metabolom di fœuj del tabacch erbivor, duperam un fluss lavurà de analìs e de calcul sviluppà en precedenza per cattà sü e deconvoluir en mod cumplet spettr MS/MS indipendent di dat a volta resoluziun di estratt vegetai ( 9 ). Chestu metud indiferenzià (ciamà MS/MS) pœu costruir spettr cumpost minga ridundant, che pœden vèss duperà per tüt i analìs a nivell cumpost descrivuu chichinsci. Chesti metabolit vegetai deconvoluu sun de vari tip, furmà de centinaia a mil metabolit (circa 500-1000-s/MS/MS chichinsci). Chichinscì, considerom la plastega metabolega ind el quader de la teoria de l'informazion e quantifegem la diversitaa e la professionalitaa del metaboloma su la bas de l'entropia de Shannon de la distribuzion de la frequenza metabolega. Duperant la formula implementada prima (8), g’hem calculà un insema de indicadur che pœden vèss duperà per quantificà la diversità del metabolom (indicadur Hj), la specializaziun del profil metabolich (indicadur δj) e la specificità metabolich de un singul metabolit (indicadur Si) . Ancamò, g’hem aplicà l’Indici de plasticità a distanza relatif (RDPI) per quantificar l’inducibilità del metabolom di erbivor (Figura 1A) (30). Denter de chestu quader statistich, tratem el spettru MS/MS cuma unità de informaziun de bas, e elaboram l’abundanza relatif de MS/MS en una mapa de distribuziun de frequenza, e dopu duperam l’entropia de Shannon per stimar la diversità del metabolom. La specializazion del metaboloma l’è mesurada de la specificitaa media de un singol spetri MS/MS. Donca, l'aument de l'abundanza de una quai class MS/MS dop l'induzion dei erbivor al se trasforma in inducibilitaa spetral, RDPI e specializazion, çoè l'aument de l'indix δj, perqè se produxen metabolits plussee specializads e se produx un indix Si volt. L’abbassament del indiss de diversità Hj riflett che o el nümer de MS/MS generà l’è redut o che la distribuziun de la frequenza del profil cambia en una direziun menu uniform, reducend insema sò incerteza cumplesiva. Travers el calcul del indis Si, l’è pusibel sottalinear qual MS/MS sun induu de certi erbivor, al cuntrari, qual MS/MS respond minga a l’induziun, che l’è un indicadur ciave per distinguir la previsiun MT e OD.
(A) Descritur statistich duperà per l’induzibilità di dati (RDPI) MS/MS erbivor (H1 a Hx), la diversità (indis Hj), la specializaziun (indis δj) e la specificità del metabolit (indis Si). Un aument del grad de specializazion (δj) l’indica qe, in media, se produrann metabolits specifeg plussee erbivor, inscambi una diminuzion de la diversitaa (Hj) l’indica una diminuzion de la produzion de metabolits o una distribuzion irregolar dei metabolits ind la mapa de distribuzion. El valor Si al valuta se el metabolit l’è specifeg per una certa condizion (qì, erbivor) o al contrari mantegnud a l’istess nivell. (B) Diagramma cuncetual de la previsiun de la teuria de la difesa duperand l’ass de la teuria del informaziun. La teoria OD la preved qe l'atac dei erbivor al aumentarà i metabolits de difesa, aumentand insì el δj. Ind el medem temp, el Hj al disminuiss perqè el profil l’è reorganizad vers l’incerteza redota dei informazion metabolege. La teoria MT la preved qe l'atac dei erbivor al causarà cambiaments miga direzionai ind el metaboloma, aumentand insì el Hj comè indicador de aumentada incerteza dei informazion metabolege e causand una distribuzion casual de Si. G’hem anca propost un modell mist, el meior MT, indov qe un quai metabolit cont valor de difesa plussee volts al sarà particolarment aumentad (valur Si volt), inscambi oltr mostren resposts casuai (valur Si plussee bas).
Duperant i descritur de la teuria del informaziun, interpretem la teuria de la DO per preveder che i cambiament de metabolit speciai induu di erbivor en un stat costitutif minga induu purtaran a (i) un aument de la specificità metabolich (indis Si) che guida la specificità metabonomich (indis δj) L’aument de) certi grupp de metabolit speciai cunt un valur de difesa püsee volt, H indix) a causa del cambiament de la distribuzion de la frequenza metabolega a una distribuzion del corp plussee de leptina. A nivell de un singol metabolit, l’è prevista una distribuzion ordenada de Si, indov qe el metabolit l’aumentarà el valor de Si segond el so valor de difesa (Figura 1B). Luungh qella linea qì, spiegam la teoria MT per preveder qe l'eccitazion la portarà a (i) cambiaments miga direzionai ind i metabolits cont el resultad de una diminuzion de l'indix δj e (ii) de un aument de l'indix Hj dovud a un aument de l'incerteza metabolega. O casualità, che pœu vèss quantificà del entropia de Shannon sotta furma de diversità generalizada. Per quant riguarda la composizion metabolega, la teoria MT la prevedrà la distribuzion casual de Si. Tegnind cont qe certs metabolits inn in condizion specifege in condizion specifege, e oltre condizion inn miga in condizion specifege, e el so valor de difesa al dipend de l'ambient, hem anca propost un modell de difesa mista, indov qe δj e Hj inn distribuids in duu long Si Aumentar in tute i direzion, inscambi certs oltr grup de metabolits particolar aumentarann ​​un valor de difesa volt, qe domà certs grup de metabolit plussee volts, qe i g’havaran Si, distribuziun (Figura 1B).
Per testar la previsiun ridefinida de la teuria de la difesa sül ass del descritur de la teuria del informaziun, g’hem cressü larv erbivor espert (Ms) o generalist (Sl) süi fœui del Nepenthes pallens (Figura 2A). Duperant l’analìs MS/MS, g’hem recuperà 599 spettr MS/MS minga ridundant (file di dat S1) di estratt de metanol de tessü de fœuj cattà sü dopu l’alimentaziun di bigòtt. Duperà i indici RDPI, Hj e δj per visualizar la riconfiguraziun del contenuu di informaziun en i file de configuraziun MS/MS rivela mutif interessant (Figura 2B). La tendenza complessiva l’è qe, comè descrivud del descritor de l’informazion, quand qe i big seguten a mangiar i fœie, el grad de tuta la reorganizazion metabolega l’aumenta ind el temp : 72 ore dop qe l’erbivor al mangia, el RDPI l’aumenta significativament. Rispett al cuntrol minga dannegià, Hj l’è stà significativament redut, che l’è dovüu al aument del grad de specializaziun del profil metabolich, che l’è stà quantificà del indis δj. Chesta tendenza aparent l’è coerent cunt i previsiun de la teuria OD, ma l’è incoerent cunt i previsiun principai de la teuria MT, che cret che i cambiament casual (minga direziunai) en nivell de metabolit sun duperà cuma camuflaj difensif (Figura 1B). Anca se el contenut elicitor de la secrezion oral (OS) e el comportament alimentar de qei duu erbivor qì inn diferents, el so alimentazion direta l’ha portad a cambiaments simil ind i direzion de Hj e δj durant i period de regœi de 24 ore e 72 ore. L’ünica diferenza l’è stada a 72 ur de RDPI. Confrontad a quell causad de l'alimentazion de Ms, el metabolism complessiv indot de l'alimentazion de Sl l'era plussee volt.
(A) Progetaziun sperimental: i erbivor porcei comun (S1) o espert (Ms) sun alimentà cun fœui desalinà di piant en vas, menter per l’erbivor simulà, el SO de Ms (W + OSM) l’è duperà per gestir la punziun di posiziun standardizà di fœui ferì. Larve S1 (W + OSSl) o aqua (W + OSS). El cuntrol (C) l’è una fœuja minga dannegiada. (B) Inducibilità (RDPI cunfruntà cun la carta de cuntrol), diversità (indis Hj) e indis de specializaziun (indis δj) calculà per la mapa di metabolit special (599 MS/MS; file di dat S1). I asterisc indican di diferenzi significatif intra l’alimentaziun diretta di erbivor e el grupp de cuntrol (pruva t de Student cun pruva t accuppiada, *P<0,05 e ***P<0,001). ns, minga impurtant. (C) Indiss de resoluziun del temp del principal (scatola blu, aminoacid, acid organich e zücher; file di dat S2) e del spettru di metabolit special (scatola ross 443 MS/MS; file di dat S1) dopu el tratament erbivor simulà. La banda de culur se riferiss a l’interval de fiducia del 95%. L’asterisc indica la diferenza significativa intra el tratament e el cuntrol [analìs quadratich de varianza (ANOVA), seguida de la diferenza onestament significativa de Tukey (HSD) per i cunfrunt multipli post hoc, *P<0,05, **P<0,01 E *** P <0,001]. (D) Specializaziun di grafich de dispersiun e di profil de metabolit speciai (campiun ripetù cun tratament diferent).
Per esplorar se el rimodellament indot dei erbivor a nivell del metabolom al se riflett ind i cambiaments ind el nivell dei singoi metabolits, prima sem concentrads sui metabolits studiads in precedenza ind i fœie del Nepenthes pallens cont una resistenza dimostrada ai erbivor. I amid fenoleg inn coniugads idrossicinamamida-poliamina qe se accumulen durant el process erbivor dei inset e inn cognossuds per redur la prestazion dei inset (32). G’hem cercà i precursur di curispundent MS/MS e g’hem tratà luur cürvi cinetich cumulatif (Figura S1). Minga per sorpresa, i derivà del fenol che sun minga diretament coinvolt in de la difesa cuntra i erbivor, cuma l’acid clorogenich (CGA) e la rutina, sun sottaregulà dopu l’erbivor. Al cuntrari, i erbivor pœden render i amid de fenol putent. L'alimentazion continua dei duu erbivor l'ha risultad ind l'istess spetri de ecitazion dei fenolamide, e qell sqema qì l'era particolarment evident per la sintesi de novo dei fenolamide. L’istess fenomen l’è osservad quand se esplora la via di glicosidi de diterpen 17-idrossigeranil nonanediol (17-HGL-DTG), che produss un grand nümer de diterpen aciclich cun funziun antierbivor eficach (33), di cui Ms Feeding g’ha profilà un espresiun simil).
El pusibel svantagg di esperiment de alimentaziun dirett di erbivor l’è la diferenza in del tass de consum di fœui e in del temp de alimentaziun di erbivor, che rend dificil eliminar i effet specifich di erbivor causà di ferit e di erbivor. Per dacch rispòsta meji a la specificità di spècc erbivor de la rispòsta metabolich induuda di fœui, g’hem simulà l’alimentaziun di larv Ms e Sl aplicànd subit l’OS appena cattà sü (OSM e OSS1) a la puntura standard W di posiziun coerent di fœui. Chesta procedüra l’è ciamada tratament W + OS e standardiza l’induziun tempizzand en mod precis l’inizi de la rispòsta elicitada del erbivor senza causar efet de cunfusiun di diferenzi in del tass o in de la quantità de perdita de tessü (Figura 2A) (34). Duperant el pipeline de analìs e de calcul MS/MS, g’hem recuperà 443 spettr MS/MS (file de dati S1), che se soraponevan ai spettr precedentement assemblà di esperiment de alimentaziun dirett. L’analis de la teuria del informaziun de chestu insema de dati MS/MS g’ha mustrà che la riprogramaziun di metabolomi specializà süi fœuj simuland i erbivor g’ha mustrà induziun specifich del SO (Figura 2C). In particolar, rispet a'l tratament OSS1, l'OSM l'ha causà un meiorament de la specializazion del metabolom a 4 ore. Vale la pena notar qe rispet a l’insema de dats sperimentai de alimentazion direta dei erbivor, la cinetega metabolega visualizada ind el spazi bidimensional cont el drovar Hj e δj comè coordinads e la direzionalitaa de la specializazion del metaboloma in resposta a’l tratament simulad dei erbivor ind el temp Aument coerent (Figura 2D). Ind el medem temp, hem quantifegad el contenut de aminoacids, acids organeg e zuqer (file de dats S2) per indagar se qell aument mirad de la competenza del metabolom l’è dovud a la reconfigurazion del metabolism del carboni central in resposta ai erbivor simulads (Figura S2). Per spiegar mei qell sqema qì, hem monitorad ulteriorment la cinetega de l’accumulazion metabolega dei vie de fenolamida e 17-HGL-DTG tratade in precedenza. L'induzion specifega del SO dei erbivor la se trasforma ind un modei de riorganizazion diferenzial denter del metabolism de la fenolamida (Figura S3). I amids fenoleg qe contegn frazion de cumarina e cafeoil inn preferenzialment indots de OSS1, inscambi i OSM scaten una specifega induzion de coniugads de ferulil. Per la via 17-HGL-DTG, l’è stada rilevada l’induziun diferenzial del SO travers di prudot de malonilaziun e dimalonilaziun a vall (Figura S3).
Sucesivament, g’hem stüdià la plasticità del trascritom induuda del SO duperand l’insema de dati de microarray in del curs del temp, che simula l’üs di OSM per tratar i fœui di fœui de la pianta rosetta en i erbivor. La cinetich del campiunament se surapunt fondamentalment cun la cinetich duperada en chestu stüdi de metabolomich (35). Rispett a la riconfiguraziun del metabolom induè la plasticità metabolich l’è particularment aumentada in del temp, osservem esplosiun de trascriziun transitori en fœui induu de Ms, induè l’inducibilità del trascritom (RDPI) e la specializaziun (δj) sun a 1 G’he stà un aument significatif di ur, e la diversità (Hj) l’è stada reduuda en mod significatif del espresiun de BMPx, el BMP1. de la specializazion del trascrit (Figura S4). I fameie de jen metaboleg (comè la P450, la glicosiltrasferasi e l'aciltrasferasi BAHD) i partecipen a'l process de assemblaj de metabolits speçai de unitaa struturai derivade del metabolism primari, segond el modell de volta specializazion precoç menzionad. Come studi de cas, l’è staita analizada la via de la fenilalanina. L’analìs g’ha cunfermà che i jen nuclear in del metabolism de la fenolamida sun altamente induù del SO en i erbivor rispett ai piant minga atirà e sun streitament allineà en luur mudei de espresiun. El fator de trascrizion MYB8 e i jen struturai PAL1, PAL2, C4H e 4CL a vall de qella via qì hann mostrad un'inizi precoç de la trascrizion. I aciltrasferasi qe jœgen una part ind l'assemblaj final de la fenolamida, comè l'AT1, el DH29 e el CV86, i mostren un modei de regolazion in su prolungad (Figura S4). I osservazion de sora indiqen qe l'inizi precoç de la specializazion del trascritom e el meiorament sucessiv de la specializazion metabolomega inn una modalitaa acopiada, qe la pœl vesser dovuda a'l sistema de regolazion sincron qe l'inizia una potenta resposta de difesa.
La riconfiguraziun in de la segnalaziun ormonai vegetai funziuna cuma un strat de regolaziun che integra i informaziun erbivor per riprogramar la fisiologia di piant. Dopu la simulaziun di erbivor, g’hem mesurà la dinamich cumulativa di categurì ormonai vegetai ciaf e g’hem visualizà la coespresiun tempural intra luur [coeficient de correlaziun de Pearson (PCC)> 0,4] (Figura 3A). Cuma previs, i ormon vegetai ligà a la biosintès sun cùlegà denter de la red de coespresiun ormonai vegetai. Ancamò, la specificità metabolich (indis Si) l’è mapada a chesta red per mett en evidenza i ormon vegetai induù di tratament diferent. Sun dissegnà dü aree principai de rispòsta specifich erbivor: una l’è in del grupp JA, induè JA (la sò furma biologicament ativa JA-Ile) e olter derivà de JA mostran el puntegg Si püsee volt; l’olter l’è l’etilen (ET). La giberellina g’ha mustrà sultant un aument moderà de la specificità di erbivor, menter olter ormon vegetai, cuma la citochinina, l’auxina e l’acid abscisich, g’havevan una bas specificità de induziun per i erbivor. Rispett al üs de sultant W + W, l’amplificaziun del valur de picc di derivà de JA travers l’aplicaziun OS (W + OS) pœu vèss trasfurmada en un indicadur specifich fort di JA. Inscì, l’OSM e l’OSS1 cun contenüu elicitor diferent sun famus per causar un accumulaziun simil de JA e JA-Ile. A diferenza de OSS1, l’OSM l’è specifegament e fortament indot dei OSM, inscambi l’OSS1 l’amplifica no la resposta dei feride basai (Figura 3B).
(A) Analìs de la red de coespresiun basà sul calcul PCC de la simulaziun cinetich del accumul de ormon vegetai induu di erbivor. El gròpp rapresenta un singul ormon vegetal e la dimensiun del gròpp rapresenta l’indis Si specifich del ormon vegetal intra i tratament. (B) Accumulaziun de JA, JA-Ile e ET en fœui causà de tratament diferent indicà de culur diferent: albicocc, W + OSM; blu, W + OSSl; nero, W + O; gris, C (cuntrol) . I asterisch indican di diferenzi significatif intra tratament e cuntrol (ANOVA a dü vias seguida de cunfront multiplo post hoc HSD de Tukey, *** P <0,001). Analis de la teuria del informaziun de (C)697 MS/MS (file di dati S1) in de la biosintès JA e spettru de perceziun indebolì (irAOC e irCOI1) e (D)585 MS/MS (file di dati S1) en ETR1 cun segnal ET indebolì Dü tratament simulà de linea de cuntrol per erbivor g’han scatenà el plan de vehicul. I asterisc indican di diferenzi significatif intra el tratament W+OS e el cuntrol minga dannegià (ANOVA a dü vias seguida del cunfront multiplo post hoc de Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). (E) Grafich dispersi de oposiziun dispersi a la specializaziun. I color representen divers cep jenetegament modifegads; i simbul rapresentan diferenti metud de tratament: triangul, W + OSS1; retangul, W + OSM; sèrcc C
Dopu, duperam un cep geneticament mudificà de Nepentes atenuà (irCOI1 e sETR1) en i pasagg ciave de la biosintès JA e ET (irAOC e irACO) e de la perceziun (irCOI1 e sETR1) per analizar el metabolism de chesti dü ormon vegetai sül contribut de riprogramaziun di erbivor El relatif. En cunformità cunt i esperiment precedent, g’hem cunfermà l’induziun de erbivor-OS en piant portadur vœui (EV) (Figura 3, C a D) e la diminuziun cumplesiva del indis Hj causà del OSM, menter l’indis δj l’è aumentà. La rispòsta l’è püsee marcada de la rispòsta scatenada de OSS1. Un grafich a dü linee duperand Hj e δj cuma coordinà mustra la deregolamentaziun specifich (Figura 3E). La tendenza plussee ovvia l'è qe ind i cep senza segnal JA, la diversitaa del metaboloma e i cambiaments de specializazion causads dei erbivor inn asquas completament eliminads (Figura 3C). Al cuntrari, la perceziun ET mut en i piant sETR1, anca se l’effèt cumplesif süi cambiament in del metabolism erbivor l’è tant püsee bass de chel de la segnalaziun JA, atenua la diferenza en indici Hj e δj intra i ecitaziun OSM e OSS1 (Figura 3D e Figura S5). . Quest l'indica qe, de soraplu a la fonzion central de la traduzion del segnal JA, la traduzion del segnal ET la serviss anca comè una regolazion de la resposta metabolega specifega de la speça dei erbivor. Coerent cun chesta funziun de sintonizaziun, g’he stà no un cambiament in del inducibilità cumplesiva del metaboloma en i piant sETR1. D’oltra part, rispett ai piant sETR1, i piant irACO g’han induu ampiezz cumplesif simil de cambiament metabolich causà di erbivor, ma g’han mustrà puntegg Hj e δj significativament diferent intra i sfid OSM e OSS1 (Figura S5).
Per identifegar metabolits specializads qe g’hann dei contributs importants a la resposta specifega dei erbivor e perfezionar la soa produzion a travers i segnai ET, hem drovad el metod strutural MS/MS desvilupad in precedenza. Chestu metud se basa sul metud de bi-clustering per rededur la famèja metabolich di framment MS/MS [prudot a punt nurmalizà (NDP)] e sul puntegg de someianza basà sü la pèrt neutral (NL). L’insema de dati MS/MS costruì travers l’analìs di linee transgenich ET g’ha prodott 585 MS/MS (file di dati S1), che l’è stà risolt raggruppand-i en set modul principai MS/MS (M) (Figura 4A). Quaivun de qei modul qì inn densament imbalads cont metabolits speçai caraterizads in precedenza : per esempi, M1, M2, M3, M4 e M7 inn ricc de vari derivads fenol (M1), glicosids flavonoids (M2), zuqer acil (M3 e M4) e 17-HGL-DTG (7M). De soraplu, l’informazion specifega metabolega (indix Si) de un singol metabolit in ogni modul l’è calcolada e la soa distribuzion de Si la pœl vesser vista intuitivament. In curt, i spettri MS/MS qe mostren una volta specificitaa de erbivor e de jenotip inn caraterizads de volts valor de Si e i statistege de la kurtosi indiqen la distribuzion del pel ind l'angol de la coa destra. Una distribuziun colloid magra inscì l’è stada rilevada en M1, induè l’amida de fenol g’ha mustrà la fraziun Si püsee volta (Figura 4B). El 17-HGL-DTG inducibil erbivor menziunà prima en M7 g’ha mustrà un puntegg Si moderà, indicand un grad moderà de regolaziun diferenzial intra i dü tip de SO. Al contrari, la major part dei metabolits specializads prodots costitutivament, comè la rutina, el CGA e i zuqer acil, inn intra i puntegg Si plussee bass. Per esplorar mei la complessitaa struturala e la distribuzion del Si intra i metabolits speçai, l’è staita costruida una red molecolar per ogni modul (Figura 4B). Una predizion importanta de la teoria OD (riassuntada ind la figura 1B) l’è qe la reorganizazion de metabolits speçai dop l'erbivor la dovaria portar a cambiaments unidirezionai ind i metabolits cont un volt valor de difesa, specialment cont l'aumentar la soa specificitaa (in oposizion a la distribuzion casual) Modalità) Metabolit de difesa prevedud de la teoria MT. La plupart dei derivads de fenol accumulads in M1 inn fonzionalment ligads a’l declin de la prestazion dei insets (32). Quand se cunfruntan i valur de Si en i metabolit M1 intra i fœui induu e i fœui custituent di piant de cuntrol EV a 24 ur, g’hem osservà che la specificità metabolich de tanti metabolit dopu i insètt erbivor g’ha una tendenza a aument significatif (Figura 4C). L’aument specifich del valur de Si l’è stà rilevà sultant en i fenolamid difensif, ma nissun aument del valur de Si l’è stà rilevà en olter fenol e metabolit minga cognussü che coesisten en chestu modül. Chestu l’è un mudel specializà, che l’è ligà a la teuria del OD. I principai predizion dei cambiaments metaboleg causads dei erbivor inn coerents. Per verificar se chesta particularità del spettru de la fenolamida l’è stada induuda de ET specifich per OS, g’hem tratà l’indis Si del metabolit e g’hem causà un valur de espresiun diferenzial intra OSM e OSS1 in di genotip EV e sETR1 (Figura 4D). Ind el sETR1, la diferenza indota de la fenamida intra OSM e OSS1 l’è staita notevolment reduxida. El metud de bi-clustering l’è stà aplicà anca ai dat MS/MS cattà sü en cep cun JA insufisent per dedur i principai modul MS/MS ligà a la specializaziun metabolich regulada de JA (Figura S6).
(A) I resultà de raggruppament de 585 MS/MS basà sü framment cundivis (sœmeanza NDP) e perdita neutral cundivisa (sœmeanza NL) fan che el modül (M) l’è coerent cun la famèja cumpost famusa, o per una composiziun de metabolit minga cognusüda o mal metabolizada. Insema a ogni modül, l’è mustrada la distribuziun specifich (Si) del metabolit (MS/MS). (B) Red molecùlar modular: i nodi rapresentan MS/MS e i bord, i puntegg MS/MS NDP (ross) e NL (blu) (cut-off,> 0,6). L’indis de specificitaa del metabolit graduad (Si) colorad su la bas del modul (a sinistra) e mapad a la red molecolar (a destra). (C) Modul M1 de la pianta EV en stato costitutif (cuntrol) e induu (erbivor simulà) a 24 ur: diagramm de la red molecùlar (el valur Si l’è la dimensiun del gròpp, la fenolamida difensiva l’è evidenziada en blu). (D) El diagramm de la red molecùlar M1 de la linea del spettru sETR1 cun perceziun EV e ET indebulida: el cumpost fenolich rapresentà del nodo del sèrcc verd e la diferenza significativa (valur P) intra i tratament W + OSM e W + OSS1 cuma dimensiun del nodo. CP, N-cafeoil-tirosina; CS, N-cafeoil-spermidina; FP, acid N-ferulico ester-acido urico; FS, N-ferulil-spermidina; CoP, N', N “-Comarolil-tirosina; DCS, N’, N”-dicaffeoil-spermidina; CFS, N', N”-caffeoil, feruloil-spermidina; Licio barbaro en fiœul de lupo; Nick. O-AS, zücher O-acil.
A’l hem ampliad ulteriorment l'analisi de un singol jenotip de Nepenthes atenuad ai popolazion naturai, indov qe dei forts cambiaments intraspecifeg ind i nivei de JA erbivor e ind i nivei de metabolit specifeg inn staits descrivuds in precedenza ind i popolazion naturai (26). Dupera chestu insema de dat per cuprir 43 germoplasmi. Chesti germplasm sun furmà de 123 spècc de piant de N. pallens. Chesti piant sun stà prelevà di sèm cattà sü en diferent habitat natif en Utah, Nevada, Arizona e California (Figura S7), g’hem calculà la diversità del metabolom (chichinsci ciamada livel de populaziun) diversità β) e la specializaziun causada del OSM. In coerenza coi studi precedents, hem osservad una vasta varietaa de cambiaments metaboleg longh i assi Hj e δj, qe l’indica qe i germoplasma g’hann diferenze significative ind la plastega dei so resposts metabolege ai erbivor (Figura S7). Chesta organizaziun regorda i osservaziun precedent sül interval dinamich di cambiament di JA causà di erbivor e g’ha mantegnuu un valur volt parècc en una singula populaziun (26, 36). Duperant JA e JA-Ile per testar la correlaziun a livel cumplesif intra Hj e δj, g’hem descuvert che g’he una correlaziun pusitif significativa intra JA e l’indiss de diversità e specializaziun del metabolom β (Figura S7). Quest al sujeriss qe l'eterojeneitaa indota dei erbivor ind l'induzion dei JA rilevada a nivell de popolazion la pœl vesser dovuda a polimorfism metaboleg ciav causads de la selezion de inset erbivor.
I studi precedents hann mostrad qe i jener de tabac inn tant diferents ind el tip e ind la dipendenza relativa dei difese metabolege indote e costitutive. Se pensa che chesti cambiament in de la trasduziun del segnal antierbivor e in di capacità de difesa sun regulà de la pressiun de la populaziun di insètt, del cìclo vital di piant e di cust de produziun de difesa in de la nichia indué cress una certa spècc. G’hem stüdià la coerenza del rimudelament del metabolom di fœui induu di erbivor de ses spècc de Nicotiana natif del Nord America e del Sud America. Qei spece qì inn streitament imparentade cond el Nepente del Nord America, çoè el Nicolas Bociflo. La, N. nicotini, nicoziana n. erba atenuada, tabacch linear, tabacch (nicoziana spegazinii) e tabacch a fœuj de tabacch (figura 5A) (37). Ses di chesti spècc, inclùs i spècc ben caraterizà N. per piasè, sun piant anual del clad de la petunia e i otusifoli N. sun piant peren del clad surela Trigonophyllae (38). Sucessivament, l'induzion W + W, W + OSM e W + OSS1 l'è staita faita su qei set spece qì per studiar el reorganizzazion metabolega a nivell de speça de l'alimentazion dei insets.
(A) Un arbor filojeneteg a striscia basad su la massima probabilitaa [per la sintesi nuclear de la glutamina (38)] e la distribuzion jeografega de set spece de Nicotiana streitament imparentade (culur diferents) (37). (B) Un grafich de dispersiun de diversità specializà per i profil metabolich de set spècc de Nicoziana (939 MS/MS; file di dat S1). A nivell de speça, la diversitaa del metaboloma l'è correlada negativament col grad de specializazion. L'analisi de la correlazion a nivell de speça intra la diversitaa metabolega e la specializazion e l'accumulazion de JA l'è mostrada ind la figura 2. S9. Culur, tip diferent; triangul, W + OSS1; retangul, W + OSM; (C) I dinamich de Nicotiana JA e JA-Ile sun classificà segond l’ampieza del ecitaziun del SO (ANOVA a dü vie e cunfrunt post-multiplo de Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 e * ** Per el cunfront de W + OS e W + W, P <0,001). Grafich a scatola de (D) diversità e (E) specializaziun de ogni spècc dopu la simulaziun del JA erbivor e de metil (MeJA). L’asterisc indica la diferenza significativa intra W + OS e W + W o lanolina püsee W (Lan + W) o Lan püsee MeJA (Lan + MeJa) e el cuntrol Lan (analìs a dü vie de la varianza, seguì del cunfront multiplo post hoc HSD de Tukey, *P<0,05, **P<0,01 e).
Duperant el metud a dual cluster, g’hem identificà 9 modul de 939 MS/MS (file di dati S1). La composizion de MS/MS reconfigurada de trataments diferents la varia notevolment intra i modul diferents intra i spece (Figura S8). La visualizazion de Hj (riferida qì comè γ-diversitaa a nivell de speça) e δj la rivela qe spece diferente se agregen in grup parecc diferents ind el spazi metaboleg, indov qe la division a nivell de speça l'è jeneralment plussee prominenta de l'eccitazion. Cont l’ecezion de N. linear e N. obliquus, i mostren una vasta gama dinamega de efets de induzion (Figura 5B). A l'incontrari, i spece comè la N. purpurea e la N. obtusifolia i g'hann una resposta metabolega men ovvia a'l traitament, ma el metaboloma l'è plussee divers. La distribuzion specifega de la resposta metabolega indota l’è risultada ind una correlazion negativa signifegativa intra la specializazion e la diversitaa gama (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). I cambiaments indots del SO ind i nivei de JA inn correlads positivament cont la specializazion del metaboloma e negativament correlads cont la diversitaa gama metabolega mostrada de ogni speça (Figura 5B e Figura S9). Vale la pena notar qe i spece colloquialment indicade comè spece de “risposta segnal” ind la figura 5C, comè i nematods del Nepente, el Nepente, el Nepente agud e el Nepente atenuad, hann causad segn significativ a 30 minuts. I recent fogoi de JA e JA-Ile specifeg del SO, inscambi oltr bater ciamads “segnal miga rispondent”, comè i mulin de Nepenthes, el Nepenthes polveros e la N. obtusifolia mostren domà l'induzion del bord JA-Ile senza nissuna specificitaa del SO (Figura 5C). A nivell metaboleg, comè menzionad de sora, per i Nepentes atenuads, i sostanze qe responden a’l segnal hann mostrad la specificitaa SO e hann aumentad signifegadivament el δj, reduxend intant Hj. Qell efet de iniziazion specifeg qì del SO l'è stait miga rilevad ind i spece classifegade comè spece miga reative de segnal (Figura 5, D e E). I metabolits specifeg del SO a inn compartids plussee frequentement intra i spece qe responden a'l segnal, e qei cluster qì de segnai se ragrupa cont i spece cont resposts de segnal plussee debole, inscambi i spece cont resposte de segnal plussee debole mostren men interdipendenza (Figura S8). Qell resultad qì l'indica qe l'induzion specifega del SO dei JA e la reconfigurazion specifega del SO del metaboloma a vall inn acopiads a nivell de speça.
Dopu, duperam una pasta de lanolina che g’ha denter JA de metil (MeJA) per tratar i piant per indagar se chesti mod de accoppi sun limità de la dispunibilità de JA aplicà de JA esogen, che sarà in del citoplasma di piant. La rapida desterificaziun l’è JA. A’l hem trovad l'istessa tendenza del cambiament gradual dei spece qe responden a'l segnal a spece qe responden miga al segnal causada de la fornidura continua de JA (Figura 5, D e E). In curt, el tratament MeJA g’ha riprogramà fortament i metabolom di nematod linear, N. obliqu, N. aquatich, N. pallen e N. mikimotoi, cunt el resultà de un aument significatif de δj e de una diminuziun de Hj. N. purpurea l’ha mostrad domà un aument de δj, ma miga de Hj. N. obtusifolia, qe l’è stait demostrad in precedenza de accumular nivei estremament bass de JA, al respond anca mal al tratament MeJA in termen de reconfigurazion del metabolom. Qei resultads qì indiqen qe la produzion de JA o la traduzion del segnal l’è fisiolojegament limitada ind i spece qe responden miga al segnal. Per verificar qella ipotesi qì, hem studiad i quatr spece (N. pallens, N. mulin, N. rosa e N. microfilla) indote de W + W, W + OSM e del trascritom W + OSS1 (39). Coerent col modell de rimodellazion del metaboloma, i spece inn ben separade ind el spazi del trascritom, intra i quai N. atenuad l'ha mostrad el RDPI indot del SO plussee volt, inscambi el N. gracilis l'ha havud el plussee bas (Figura 6A). Comesessia, l'è stait descovert qe la diversitaa del trascritom indota de N. oblonga l'era la plussee bassa intra i quatr spece, al contrari de la diversitaa metabonomega plussee volta de N. oblonga mostrada in precedenza in set spece. I studi precedents hann mostrad qe un insema de jen ligads ai segnai de difesa precoç, compres i segnai JA, al spiega la specificitaa dei resposts de difesa precoç indote dei elicitor ligads ai erbivor ind i spece de Nicotiana (39). El confront dei vie de segnalazion JA intra qei quatr spece qì l’ha rivelad un modell interessant (Figura 6B). La plupart dei jen in qella via qì, comè l'AOC, l'OPR3, l'ACX e el COI1, hann mostrad nivei relativament volts de induzion in qei quatr spece qì. A bon cunt, un jen ciav, el JAR4, al convertiss el JA ind la soa forma biolojegament ativa de trascrits accumulads de JA-Ile, e el so nivell de trascrizion l'è bass fiss, specialment ind i mulins N., Nepenthes pieris e N. microfilla. De soraplu, domà el trascrit de un olter jen AOS l'è stait miga rilevad in N. bifidum. Qei cambiaments qì ind l'espression jenega pœden vesser responsabel dei fenotip estrem indots de la bassa produzion de JA ind i spece anerjege del segnal e l'induzion de N. gracilis.
(A) Analis de la teuria del informaziun de la riprogramaziun di primi rispost trascriziunai de quater spècc de tabacch streitament ligà campiunà 30 minut dopu l’induziun erbivor. El RDPI l’è calculà cunfruntant i fœui induu del SO erbivor cunt el cuntrol di ferit. I color indiqen spece diferente e i simboi indiqen metods de tratament diferents. (B) Analisi de l'espression jenega ind i vie de segnalazion JA intra quatr spece. El percors JA semplificà l’è mustrà visin al grafich de la casella. Culur diferent indican diferenti metud de lavuraziun. L’asterisc indica che g’he una diferenza significativa intra el tratament W + OS e el cuntrol W + W (per el test t del Student per i diferenzi en coppi, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). OPDA, acid 12-ossofitodienoico; OPC-8: acid 0,3-osso-2(2′(Z)-pentenil)-ciclopentan-1-ottanoico.
In del ültima part, g’hem stüdià cuma el rimodellament specifich di spècc de insètt del metabolom di diferent spècc vegetai pœu vèss resistent ai erbivor. La ricerca precedent g’ha sottalineà el gener Nicotiana. La soa resistenza ai Ms e ai larve l’è tant diferenta (40). Chichinscì, hem studiad la conession intra qell modell qì e la soa plastega metabolega. Duperant i quater spècc de tabacch menziunà sora, e verificand la relaziun intra la diversità e la specializaziun del metabolom causà di erbivor e la resistenza di piant a Ms e Sl, g’hem truvà la resistenza, la diversità e la specializaziun al generalist Sl Tüt sun ligà en mod pusitif, menter la relaziun intra la diversità l’è minga cun la Fig. S10). Per quant riguarda la resistenza a S1, sia el N. chinensis atenuad qe el N. gracilis, qe in precedenza eren staits demostrads per mostrar sia i nivei de traduzion del segnal JA qe la plastega del metaboloma, i g’haveven risposts notevolment diferents a l'induzion dei erbivor, e hann anca mostrad una volta resistenza simil. Sesso.
En i ültim sessanta an, la teuria de la difesa vegetal g’ha furniu una strütüra teorich, basà sü la qual i ricercadur g’han previst un nümer cunsiderevul de evoluziun e funziun de metabolit specializà en piant. La magiur part di chesti teurì segutan no la nurmal procedüra di inferenz fort (41). Propongon previsiun ciave (3) al stess livel de analìs. Quand la verifica di previsiun ciave cunsent de analizar teurì specifich, chestu farà nà innanz el camp. Se sostegner, ma refudar i olter (42). Al cuntrari, la nœuva teuria fà di previsiun a diferenti livei de analìs e giunt un nœuf livel de consideraziun descritif (42). De tute i manere, i duu teorie proposte a nivell fonzional, MT e OD, pœden vesser facilment spiegade comè predizion importante de cambiaments metaboleg specializads causads dei erbivor : la teoria OD la cred qe i cambiaments ind el “spazi” metaboleg specializad inn estremament direzionai. La teoria MT la cred qe qei cambiaments qì sarann ​​miga direzionai e situads casualment ind el spazi metaboleg, e tenden a haver-g metabolits cont un volt valor de difesa. Esam precedent di previsiun OD e MT sun stà testà duperand un insema strècc de cumpost de “difesa” a priori. Chesti test centrà süi metabolit precluden la capacità de analizar l’entità e la traiettoria de la riconfiguraziun del metabolom durant l’erbivor e permeten no di test denter de un quader statistich coerent per dumandar previsiun ciave che pœden vèss cunsiderà en luur insema Quantificar i cambiament in del metabolom di piant. Chichinscì, g’hem duperà la tecnologia innuvativa en metabolomich basà sü la SM computaziunal e g’hem fatt un analìs de MS de deconvoluziun in de la moneda general di descritur de la teuria del informaziun per testar la distinziun intra i dü propost a livel de metabolomich global. La previsiun ciave de chesta teuria. La teoria de l’informazion ‘l é staita aplicada in tant camp, in particolar ind ol contest de la biodiversitaa e de la ricerca in su ‘l fluss nutritiv (43). Però, per quant che savèm, chesta l’è la prima aplicaziun duperada per descrif el spazi de informaziun metabolich di piant e dacch rispòsta ai prublem ecologh ligà ai cambiament metabolich temporane en rispòsta ai indizi ambientai. In particolar, l'abilitaa de qell metod qì la sta ind la soa abilitaa de confrontar modei denter e intra i spece vejetai per esaminar comè qe i erbivor se inn evoluds de spece diferente a modei macroevolutiv interspece a nivei diferents de evoluzion. Metabolism.
L’analìs di compunent principal (PCA) cunvertiss un insema de dat multivarià en un spazi de riduziun di dimensiunalità inscì che la tendenza principal di dat pœu vèss spiegada, donca l’è de solet duperada cuma tecnich esplorativa per analizar l’insema de dat, cuma el metabolom de deconvoluziun. Però, la reduziun di dimensiunal perd part del contenuu di informaziun in del insema di dat e el PCA pœu no furnir informaziun quantitatif süi carateristich che sun particularment rilevant per la teuria ecologh, cuma: cuma i erbivor riconfiguran la diversità en camp specializà (par esempi, richeza, distribuziun) e abundanza) metabolit? Quai metabolit inn predittor del stat indot de un cert erbivor? Del punt de vista de la specificità, de la diversità e del inducibilità, el contenüu informatif del profil di metabolit specifich di fœui se decompon e se descuvre che el mangià di erbivor pœu ativar un metabolism specifich. Inaspetà, g’hem osservà che, cuma descrivuu en i indicadur de la teuria del informaziun implementà, la situaziun metabolich risultant g’ha un grand surapòst dopu i atach di dü erbivor (el generalist mangià de nott Sl) e l’esperta di Solanaceae Ms. Anca se luur cumpurtament alimentar e luur cuncentraziun sun significativament diferent. Iniziatur del coniugà acid grass-aminoacid (FAC) en SO (31). Duperant el SO erbivor per tratar i ferit de punziun standardizà, anca el tratament simulà di erbivor g’ha mustrà una tendenza simil. Chesta procedüra standardizada per simular la rispòsta di piant ai atach di erbivor scancela i fatur de cunfondiment causà di cambiament in del cumpurtament alimentar di erbivor, che menan a vari grad de dann en temp diferent (34). La FAC, che l’è famusa per vèss la causa principal del OSM, la reduss el JAS e olter rispost ormonai vegetai en OSS1, menter l’OSS1 reduss cent volt (31). Però, OSS1 g’ha causà nivell simil de accumulaziun de JA rispett al OSM. L’è stà dimustrà en precedenza che la rispòsta JA en Nepenthes atenuà l’è parècc sensibil al OSM, induè el FAC pœu mantegnir sò atività anca se diluì 1:1000 cun aqua (44). Donca, rispett al OSM, anca se el FAC en OSS1 l’è bass, l’è sufisent per induir un fogorament de JA sufisent. I stüdi precedent g’han mustrà che i prutein simil ai porin (45) e i oligosacarid (46) pœden vèss duperà cuma indizi molecùlari per scatenar i rispost de difesa vegetal en OSS1. Però, l’è ancamò minga ciar se chesti elicitur en OSS1 sun responsabil del accumul de JA osservà in del stüdi atual.
Anca se g’he sun pooch stüdi che descriven i impront metabolich diferenziai causà del aplicaziun de diferenti erbivor o JA o SA esogen (acid salicilich) (47), nissun g’ha perturbà la perturbaziun specifich di spècc erbivor in de la red del erba vegetal e i sò effètt sul metabolism specifich del sistèm cumplesif. informaziun persunal. Chesta analìs g’ha cunfermà ancamò che la cunnesiun de la red ormonai interna cun olter ormon vegetai divers di JA mudela la specificità de la riorganizaziun metabolich causada di erbivor. En particular, g’hem rilevà che l’ET causà de OSM l’era significativament magiur de chel causà de OSS1. Chesta modalità l’è coerent cun püsee contenuu FAC en OSM, che l’è una cundiziun necesaria e sufisent per scatenar un esplosiun ET (48). In del cuntest del interaziun intra piant e erbivor, la funziun de segnalaziun de ET süi dinamich metabolit specifich di piant l’è ancamò sporadich e mira sultant a un singul grupp cumpost. Ancamò, la magiur part di stüdi g’ha duperà l’aplicaziun esogen de ET o di sò precursur o vari inibitur per stüdiar la regolaziun del ET, intra i quai chesti aplicaziun chimich esogen produran tanti efet secundari minga specifich. Segond el noster savè, chestu stüdi rapresenta el prim esam sistematich sü laargh scäla del ròl del ET in del üs del ET per produr e percepir piant transgenich compromess per coordinar i dinamich del metabolom di piant. L'induzion ET specifega dei erbivor la pœl a la fin modular la resposta del metabolom. La plussee significativa l'è la manipolazion transjenega dei jen de la biosintesi ET (ACO) e de la percezion (ETR1) qe l'ha rivelad l'accumulazion de novo specifega dei erbivor dei fenolamide. L’è stait demostrad in precedenza qe ET al pœl sintonizar l’accumulazion de nicotina indota de JA regoland la N-metiltrasferasi de la putrescina (49). Però, de un punt de vista mecanich, l’è minga ciar cuma ET perfeziuna l’induziun de la fenamida. De soraplu a la fonzion de traduzion del segnal de l'ET, el fluss metaboleg al pœl anca vesser spostad a la S-adenosil-1-metionina per regolar l'investiment ind i amids de poliaminofenol. La S-adenosil-1-metionina l’è ET e intermedi comun de la via biosintetega de la poliamina. El mecanism cont el qual el segnal ET al regola el nivell de fenolamida al g’ha de besogn de ulterior studi.
Per tant temp, a causa del grand numer de metabolits speçai de strutura descognossuda, l'atenzion intensa a categorie metabolege specifege l'è miga staita bona de valutar streitament i cambiaments temporai de la diversitaa metabolega dop dei interazion biolojege. Incœu, sü la bas del analìs de la teuria del informaziun, el resultà principal del acquisiziun del spettru MS/MS basà süi metabolit imparziai l’è che i erbivor che mangian o simulan i erbivor seguttan a redüss la diversità metabolich cumplesiva del metabolom di fœuj aumentand al stess temp el sò grad de specializaziun. Qell aument temporaneo qì de la specificitaa del metaboloma causad dei erbivor l’è associad cont un aument sinerjeteg de la specificitaa del trascritom. La carateristega qe la contribuiss plussee a qella specializazion qì del metabolom plussee granda (qe la g’ha un valor de Si plussee volt) l’è el metabolit special cont la fonzion erbivora caraterizada in precedenza. Chestu mudel l’è coerent cun la previsiun de la teuria OD, ma la previsiun de MT ligada al casualità de la riprogramaziun del metaboloma l’è minga coerent. Comesessia, qei dats qì inn anca coerents cont la predizion del modell mist (meior MT; Figura 1B), perqè oltr metabolits miga caraterizads cont fonzion de difesa miga cognossude pœden ancamò seguir una distribuzion casual de Si.
Un mudel impurtant caturà ulteriorment de chesta ricerca l’è che dal nivell de microevoluziun (populaziun de piant e tabacch singul) a una scäla evolutiva püsee grand (spece de tabacch strècc), diferent nivell de organizaziun evolutiva sun in de la “mejiur difesa” G’he sun di diferenzi significatif en i capacità di erbivor. Moore e coll. (20) e Kessler e Kalske (1) hann propost indipendentement de convertir i tri nivei fonzionai de biodiversitaa in orijin distints de Whittaker (50) ind i cambiaments temporai costitutiv e indots de la diversitaa qimega; qei autor qì hann miga riassunt I procedure per la recollida dei dats del metabolom su larga scala descriven miga anca comè calcolar la diversitaa metabolega de qei dats qì. En chestu stüdi, i ajustament minur a la clasificaziun funziunal de Whittaker cunsideran la diversità α-metabolich cuma diversità di spettr MS/MS en una certa pianta e la diversità β-metabolich cuma metabolism intraspecifich de bas de un grupp de populaziun Spazi e la diversità γ-metabolich sarà un’estensiun del analìs simil.
El segnal JA l’è essenzial per una vasta varietaa de resposts metabolege dei erbivor. Comesessia, la g'è una mancanza de prœve quantitative rigorose del contribud de la regolazion intraspetefega de la biosintesi JA a la diversitaa del metaboloma, e se el segnal JA l'è un sit jeneral per la diversifegazion metabolega indota del stress su una scala macroevolutiva plussee volta l'è ancamò sfuggent. G’hem osservad qe la natura erbivora de l’erbivor de Nepenthes l’indux la specializazion del metabolom e la variazion de la specializazion del metabolom denter de la popolazion dei spece de Nicotiana e intra i spece de Nicotiana streitament imparentade l’è sistemategament positivament correlada cond la segnalazion JA. De soraplu, quand qe el segnal JA l’è compromess, la specificitaa metabolega indota de un singol jenotip erbivor la sarà annullada (Figura 3, C e E). Dejà qe i cambiaments del spetri metaboleg dei popolazion naturalment atenuads de Nepente inn per la plupart quantitativ, i cambiaments ind la diversitaa e ind la specificitaa β metabolega in qella analisi qì pœden vesser largament causà de la forta ecitazion dei categorie composts riqe de metabolit. Qei class composts qì dominen una part del profil del metaboloma e i porten a una correlazion positiva coi segnai JA.
Del moment qe i mecanism bioqimeg dei spece de tabac streitament ligads a luu inn parècc diferents, i metabolits inn identifegads specifegament ind l'aspet qualitativ, donca l'è plussee analiteg. L'elaborazion de la teoria de l'informazion del profil metaboleg caturad la rivela qe l'induzion dei erbivor l'agrava el compromess intra la diversitaa gama metabolega e la specializazion. El segnal JA giœuga una funziun central en chestu compromess. L'aument de la specializazion del metaboloma l'è coerent cont la predizion principal de l'OD e l'è correlad positivament col segnal JA, inscambi el segnal JA l'è correlad negativament cont la diversitaa gama metabolega. Chesti mudei indican che la capacità OD di piant l’è principalment determinada de la plasticità de JA, sü scäla microevolutiva o sü scäla evolutiva püsee grand. I esperiments de aplicazion esojen de JA qe eviten i difets de biosintesi de JA rivelen ulteriorment qe i spece de tabac streitament imparentade pœden vesser distinte in spece qe responden a’l segnal e qe responden miga al segnal, propri comè la soa modalitaa de JA e plastega del metaboloma indota dei erbivor. I spece qe responden miga al segnal pœden no responder a causa de la soa inabilitaa de produr JA endojen e inn donca sojets a limitazion fisiolojege. Quest al pœl vesser causad de mudazion in un quai jen ciav ind la via de segnalazion JA (AOS e JAR4 in N. crescens) de. Qell resultad qì al sotlinia qe qei modei macroevolutiv interspeçai qì pœden vesser principalment guidads dei cambiaments ind la percezion e ind la resposta ormonala interna.
De soraplu a l'interazion intra piante e erbivor, l'esplorazion de la diversitaa metabolega l'è ligada a tuts i importants progress teoreg ind la recerca sul adatament biolojeg a l'ambient e l'evoluzion de traits fenotipeg compless. Cont l'aument de la quantitaa de dats aquisids dei modern struments de MS, la prœva de l'ipotesi su la diversitaa metabolega la pœl adess trascender i diferenze de metabolit individuai/categoria e far un'analisi global per rivelar modei miga spetads. In del prucess de analìs sü laargh scäla, una metafura impurtant l’è l’idea de cuncepir di mapp impurtant che pœden vèss duperà per esplurar i dat. Donca, un resultad important de la combinazion atual de metabolomega imparzial MS/MS e teoria de l'informazion l'è qe la forniss una metrega semplix qe la pœl vesser drovada per costruir dei mape per sfogliar la diversitaa metabolega su diverse scale tassonomege. L’è el requisit de bas de chestu metud. El stüdi del micro/macro evoluziun e del ecologia comunitari.
A livel macroevolutif, el center de la teuria de la coevoluziun vegetal-insètt de Ehrlich e Raven (51) l’è preveder che la variaziun de la diversità metabolich interspeci l’è la causa de la diversificaziun di lignagg vegetai. Però, en i cinquant’an de la publicaziun de chestu oper fundamental, chesta ipotès l’è stada rarament verificada (52). Chestu l’è dovüu en gran part ai carateristich filogenetich di carateristich metabolich cumparabil intra i lignagg vegetai a lunga distanza. La rarità pœu vèss duperada per ancorar i metud de analìs mira. L'atual fluss de lavorar MS/MS elaborad de la teoria de l'informazion al quantifega la someianza strutural MS/MS de metabolits miga cognossuds (senza selezion precedenta dei metabolits) e al convertiss qei MS/MS qì ind un insema de MS/MS, donca ind el metabolism professional Qei modei macro-evolutiv qì inn comparads su scala de classifegazion. Indicadur statistich facil. El process l'è simil a l'analisi filojenetega, qe la pœl utilizar l'alineament dei sequenze per quantifegar el tass de diversifegazion o evoluzion del carater senza predizion precedent.
A nivell bioqimeg, l'ipotesi de screening de Firn e Jones (53) la mostra qe la diversitaa metabolega la se mantegn a nivei diferents per fornir materiai prime per esercitar i ativitaa biolojege de metabolits precedentement miga ligads o sostituids. I metods de la teoria de l'informazion fornissen una strutura indov qe qei transizion evolutive specifege qì qe se verifegen durant la specializazion dei metabolit pœden vesser quantifegade comè part del process de screening evolutiv propost : adatament biolojegament ativ de bassa specificitaa a volta specificitaa Metabolit inibids de un cert ambient.
En tüt, ai primi temp de la biologia molecùlar sun stà sviluppà impurtant teurì de la difesa vegetal e i metud dedutif basà sü ipotès sun ampiament cunsiderà l’ünich mezz de prugress scientifich. Quest l’è dovud in gran part ai limitazion tecnege de la mesurazion de l’intregh metaboloma. Anca se i metud guidà di ipotès sun particularment util in de la scernida di olter mecanism causai, luur capacità de fär prugredir la noster cumprensiun di red biochimich l’è püsee limitada di metud computaziunai dispunibel incœu in de la scienza d’incœu che dupera tanti dat. Donca, i teurì che pœden no vèss previs sun parècc olter al fin di dat dispunibel, donca l’ipotétich ciclo de formula/test del prugress in del camp de la ricerca pœu no vèss abolì (4). Prevedem qe el fluss de lavorar computazional de la metabolomega introdot qì al pœl recrear l'interess ind i question recent (comè) e final (perqè) de la diversitaa metabolega e contribuir a una nœva era de la scienza dei dati guidada teoretegament. L’era l’ha esaminad anca mò i teorie impurtant che han ispirad i generasiün precedent.
L’alimentaziun diretta di erbivor l’è fatta cressend una larva de segond instar o larva Sl sü una singula fœuja de pianta en brocca de culur pallido de una singula pianta en fiur de rosa, cun 10 copi de pianta per pianta. I larv de insètt sun stà strincc cun morsett e el tessüt de fœuj restant l’è stà cattà sü 24 e 72 o dopu l’infeziun e cungelà rapidament e i metabolit sun stà estratt.
Simula el tratament erbivor en mod sincronizà. El metud l’è duperà rœud cun mutif en tessuu per furzar tri fil de spini sü ogni lat de la nervadüra media di tri fœui cumpletament slargà de la pianta durant el stadi de cressita de la ghirlanda de tessuu e aplicà subet 1:5 Ms. Raccògli e lavura una fœuja cuma descrivuu de sora. Duperà el metud descrivuu prima per estrar metabolit primari e ormon vegetai (54).
Per i aplicaziun esogen de JA, i tri fœui a pezz de ognun di ses piant en fiur de rosa de ognun spècc sun tratà cun 20 μl de pasta de lanolina che g’ha denter 150 μg de MeJA (Lan + MeJA) e 20 μl de lanolina püsee tratament per i ferit (Lan + MeJA) e duperà cuma purpur de cuntrol (Lan + W2). I fœui sun stà recüperà 72 o dopu el tratament, cungelà en azot liquid e cunservà a -80°C fin al üs.
Quater linie transjenege JA e ET, çoè irAOC (36), irCOI1 (55), irACO e sETR1 (48), inn staite identifegade ind el noster grup de recerca. irAOC g’ha mustrà fortement una diminuziun di nivell de JA e JA-Ile, menter el irCOI1 l’era minga sensibil ai JA. Rispett a EV, l’accumul de JA-Ile l’è aumentà. Inscì, irACO reduss la produziun de ET e rispett a EV, sETR1, che l’è insensibil a ET, aumentarà la produziun de ET.
Un spettrometer laser fotoacustich (sensur ET en temp real Sensor Sense ETD-300) l’è duperà per eseguir la misuraziun ET en mod minga invasif. Subèt dopu el tratament, la mità di fœui l’è stada tajada e trasferida en una fiala de veder sigillada de 4 ml e el spazi de la testa l’è stà lassà accumulà en 5 our. Durant la misuraziun, ogni fiala l’è stada sciacquada cunt un fluss de 2 litri/ura de aria pura per 8 minut, che prima l’era passà travers de un catalizatur furniu de Sensor Sense per scancelà CO2 e aqua.
I dati di microarray sun stà uriginariament püblicà en (35) e salvà in del Bas de dati cumplet del espresiun genich del Centr naziunal per l’informaziun biotecnologich (NCBI) (numer de acesiun GSE30287). I dat curispundent ai fœui causà del tratament W + OSM e del cuntrol minga dannezzà sun stà estratt per chestu stüdi. L’intensità grezza l’è log2. Prima del analìs statistich, la linia de bas l’è stada cunvertida e nurmalizada al sò 75° percentil duperand el pachet software R.
I dati uriginai del sequenziament del ARN (RNA-seq) di spècc Nicotiana sun stà recuperà di Archivi de letura curta del NCBI (SRA), el nümer del pruget l’è PRJNA301787, che l’è stà ripurtà de Zhou et al. (39) e proceder cuma descrivuu en (56). I dat grezz elaborà de W + W, W + OSM e W + OSS1 curispundent ai spècc de Nicotiana sun stà seleziunà per l’analìs en chestu stüdi e elaborà in de la manera seguent: Prim, i letür grezz de RNA-seq sun stà cunvertì en furmat FASTQ. HISAT2 cunvertiss FASTQ en SAM e SAMtools cunvertiss i file SAM en file BAM urdinà. StringTie l'è drovad per calcolar l'espression jenega, e el so metod de espression l'è qe g'è dei framments per mil framments de bas per milion de framments de trascrizion sequenziads.
La culonn cromatografich Acclaim (150 mm x 2,1 mm; dimensiun di partisel 2,2 μm) duperada in del analìs e la culonn de proteziun de 4 mm x 4 mm sun furmà del stess material. El seguent gradient binario l’è duperà in del sistèm de cromatografia a liquid a volt rendiment (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: de 0 a 0,5 minut, isocràtich al 90% A [aqua deionizada, 0,1% (v/v) de acetonitril e 0,05% de acid B e1 0,05% acido formico); de 0,5 a 23,5 minut, la fas gradient l’è rispettivament del 10% A e del 90% B; 23,5 a 25 minut, isocràtich 10% A e 90% B. El fluss l’è de 400μl/min. Per tüt i analìs MS, ingietar l’eluent de la culona en un analizatur a quadrupol e temp de sœul (qTOF) dotà de una surgent de eletrospray che funziuna en modalità de ionizaziun pusitif (tensiun capillar, 4500 V; uscita capillar 130 V ; Temperadüra de fluss de seccadura 200°C d1).
Effettuar un'analisi de framment MS / MS (in seguit denominada MS / MS) qe l'è irrilevant o indistinguibil dei dats per otener informazion struturai sul profil metaboleg complessiv rilevabel. El cuncett del metud indiscriminà MS/MS se funda sul fatt che el quadrupol g’ha una finestra de isulament de masa grandissima [donca, cunsidera tüt i segnai del raport masa-carica (m/z) cuma framment]. Per chestu mutif, perché el strüment Impact II l’è minga stà bon de crear un inclinaziun CE, sun stà fatt diferent analìs indipendent duperand di valur de energia de collisiun de dissociaziun (CE) induda de la collisiun aumentà. En curt, prima analizar el campiun cun ionizaziun UHPLC-eletrospray/qTOF-MS duperand la modalità de spettrometria de mass singul (bas cundiziun de frammentaziun generà de la frammentaziun in surgent), scansiunand de m/z 50 a 1500 a una frequenza de ripetiziun de 5 Hz. Duperà l’azot cuma gas de sconter per l’analìs MS/MS e fa di misuraziun indipendent ai seguent quater diferent tensiun de dissociaziun induù de la sconter: 20, 30, 40 e 50 eV. Durant tüt el prucess de misuraziun, el quadrupol g’ha la finestra de isulament de mass püsee grand, de m/z 50 a 1500. Quand el corp frontal m/z e l’esperiment de laargheza de isulament l’è impostà sü 200, l’interval de mass l’è ativà automaticamente dal software operatif del strüment e 0 Da. Scansiona i framment de masa cuma en modalità massa singula. Duperà furmà de sodi (50 ml de isopropanol, 200 μl de acid formich e 1 ml de soluziun aquosa de NaOH 1M) per la calibraziun de masa. Duperant l’algoritmo de calibraziun de volta precisiun de Bruker, el file di dat l’è calibrà dopu avegh eseguì el spettru medi en un cert periud de temp. Dupera la funziun de esportaziun del prugrama de analìs di dat v4.0 (Brook Dalton, Brema, Germania) per cunvertir i file di dat grezz en furmat NetCDF. L’insema de dati MS/MS l’è stà salvà in del database metabolomich avèrt MetaboLights (www.ebi.ac.uk) cunt el nümer de adesiun. MTBLS1471.
L’assemblament MS/MS pœu vèss realizà travers l’analìs de correlaziun intra segnai de qualità MS1 e MS/MS per bas e volta energia de sconter e regul nöf implementà. El script R l’è duperà per realizà l’analis de correlaziun de la distribuziun del precursur al prudut e el script C# l’è duperà per implementar i regul.
Per redür i falsi errur pusitif causà del rumòr de sfund e de la falsa correlaziun causà del rilevament di certi carateristich m/z en sultant pooch campiun, duperam la funziun “picc riempì” del pachet R XCMS (per la curreziun del intensità del rumòr de sfund) Dovaria vèss duperà per sostituir el “peak de fond” (peak”). Quand che la funziun de picc de riempiment l’è duperada, g’he sun ancamò tanti valur de intensità de “0′′ in del insema di dat che influenzan el calcul de la correlaziun. Dopu, cunfruntem i resultà del elaboraziun di dat ottegnuu quand se dupera la funziun de picc de riempiment e quand che la funziun de picc de riempiment l’è minga duperada, e calculem el valur de rumòr de sfund currètt sü la bas de chesti valur de intensità cunt el valur de sfund calculà G’hem anca cunsiderà sultant i carateristich induè l’intensità superava tri volt el valur de sfund e i g’hem cunsiderà cuma “ver vètt”. Per i calcul PCC, sun cunsiderà sultant i segnai m/z del precursur del campiun (MS1) e i insema de dati de framment cun almen vòtt vètt veri.
Se l’intensità de la carateristich de qualità precursur in del inter campiun l’è ligada en mod significatif cun l’intensità ridotta del stess carateristich de qualità che l’è suget a bas o volta energia de sconter e la carateristich l’è minga etichettada cuma picc izotopich de CAMERA, pœu vèss ulteriorment definida. Donca, calculand tüt i pusibel copi precursor-prudot en 3 s (la finestra de temp de ritenziun stimada per la ritenziun de picc), se fà l’analìs de correlaziun. Sultant quand el valur m/z l’è inferiur al valur del precursur e la frammentaziun MS/MS la se verifica in del stess posiziun del campiun in del insema di dat del precursur da induè deriva, l’è cunsiderà un ciapp.
Sü la bas de chesti dü regul facil, escludem i framment specificà cun valur m/z magiur de m/z del precursur identificà, e sü la bas de la posiziun del campiun indué cumpariss el precursur e del framment specificà. L’è anca pusibel seleziunar i carateristich de qualità generà de tanti framment in-source generà en modalità MS1 cuma precursur candidà, generand inscì cumpost MS/MS ridundant. Per redür chesta redundanza di dat, se la somejanza NDP di spettr süpera el 0,6 e partegnen al “grupp pc” del cromatogramm annutà de CAMERA, i unirem. Per finì, unim tüt i quater resultà CE asocià al precursur e ai framment in del spettru cumpost deconvoluto final seleziunand el picch de intensità püsee volta intra tüt i picch candidà cunt el stess valur m/z a diferenti energie de sconter. I pass de lavorazion sucessiv se basen sul concet de spetri composit e tegnen cont dei diverse condizion CE necessarie per massimizar la probabilitaa de frammentazion, perqè un quai framment al pœl vesser rilevad domà sota una specifega enerjia de collision.
RDPI (30) l’è stà duperà per calculà l’inducibilità del profil metabolich. La diversitaa del spetri metaboleg (indis Hj) la deriva de l’abundanza de precursor MS/MS cont l’utilizar l’entropia de Shannon de la distribuzion de frequenza MS/MS cont l’equazion seguenta descrivuda de Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) induè Pij curispunt a la frequenza relatif del i-° MS/MS in del j-° campiun (j = 1, 2,..., m) (i = 1, 2, ..., m) t).
La specificità metabolich (indis Si) l’è definida cuma l’identidà de espresiun de un cert MS/MS en relaziun a la frequenza intra i campiun cunsiderà. La specificità MS/MS l’è calculada cuma Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Dupera la furmula seguent per mesurar l’indis δj specifich del metabolom de ogni campiun j e la media de la specificità MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
I spettri MS/MS sun allineà en copi e la someianza l’è calculada sü la bas di dü punteggi. Prim, duperand el NDP standard (cognusuu anca cuma metud de correlaziun cosinus), dupera l’equaziun seguent per puntegiar la sœmeanza del segment intra i spettr NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 indué S1 e S2 cuma spettr, e iWS2 en mod curispundent, per el spettr, i rapresenta el pes basà sü l’intensità de picc che la diferenza del i-° picc comun intra i dü spettr l’è minur de 0,01 Da. El pes l’è calculà inscì: W = [intensità de picc] m [qualità] n, m = 0,5, n = 2, cuma sugerì de MassBank.
L’è stà implementà un segond metud de puntuaziun, che cumportava l’analìs de la NL cundivisa intra MS/MS. A tal fin, g’hem duperà i 52 list NL incuntrà despess durant el prucess de frammentaziun MS en tandem, e la NL püsee specifich (file di dat S1) che l’è stada precedentement annutà per el spettru MS/MS di metabolit segondari di spècc de Nepenthes indebolì ( 9, 26). Crea un vetur binario de 1 e 0 per ogni MS/MS, curispundent rispettivament al curent e al inesistent de quai NL. Sü la bas de la sœmeanza de la distanza euclidea, el puntegg de sœmeanza NL l’è calculà per ogni copia de vetur NL binari.
Per eseguir un raggruppament dual, g’hem duperà el pachet R DiffCoEx, che l’è basà sü un’estensiun del Analìs de coespresiun genich ponderada (WGCNA). Duperant i matris de puntuaziun NDP e NL di spettr MS/MS, duperam DiffCoEx per calculà la matris de correlaziun cumparativa. El raggruppament binario l’è fatt impostand el parameter “cutreeDynamic” sü metud = “ibrid”, Alteza de taj = 0,9999, Divisiun prufunda = T e Dimensiun minim de raggrupp = 10. El codes surgent R de DiffCoEx l’è stà scaricà de un file adiziunal 1 de Tesson et al. (57); El pachet software R WGCNA necessari al pœl vesser trovad ind el paqet de coespression/paqet R/WGCNA.
Per fär l’analìs de la red molecùlar MS/MS, g’hem calculà la cunnetività spettraal accuppiada sü la bas di tip de sœmeanza NDP e NL e g’hem duperà el prugrama Cytoscape per visualizar la topologia de la red duperand el layout organich in del aplicaziun de estensiun del algoritmo de layout CyFilescape yFiles.
Duperà la versiun R 3.0.1 per fär un analìs statistich süi dat. La significà statistich l’è stada valutada duperand l’analìs a dü vie de varianza (ANOVA), seguida del test post-hoc de la diferenza onestament significativa (HSD) de Tukey. Per analizar la diferenza intra el tratament erbivor e el cuntrol, l’è stada analizà la distribuziun a dü cu di dü grupp de campiun cun la stess varianza duperand el test t de Student.
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La teoria de l’informazion la forniss una moneda universal per el confront dei metabolomi speçai e la predizion dei teorie de la difesa dei test.
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