L’articul fà part del argument de ricerca “Mejorar la resistenza di legum ai patogen e ai parassit”, varda tüt i 5 articul
L’agent causal de la necrosi de la malatia di piant füngich (Lib.) de Bary dupera una strategia a püsee livei per infetar diferenti piant ospit. Chestu stüdi proponn l’üs de la diamina L-ornitina, un aminoacid minga proteich che stimula la sintès de olter aminoacid esenziai, cuma strategia de gestiun alternativa per mejorar i rispost molecùlari, fisiologech e biochimich del Phaseolus vulgaris L. al muff bianch causà del Pseuotidoler. I esperiment in vitro g’han mustrà che la L-ornitina inibiva en mod significatif la cressita micelial de S. pyrenoidosa en mod dipendent de la dosi. Ancamò, podaria redür significativament la gravità del muff bianch en cundiziun de serra. Ancamò, la L-ornitina g’ha stimulà la cressita di piant tratà, indicand che i cuncentraziun testà de L-ornitina l’eran minga fitotossich per i piant tratà. Ancamò, la L-ornitina g’ha aumentà l’espresiun di antiossidant minga enzimatich (fenolich solubil total e flavonoid) e di antiossidant enzimatich (catalasi (CAT), perossidasi (POX) e polifenol ossidasi (PPO)), e g’ha aumentà l’espresiun de tri jen ligà ai antiossidant, PGRv1, PGRv1). De soraplu, l'analisi in silico l'ha rivelad la presenza de una putativa proteina de ossaloacetad acetilidrolasi (SsOAH) ind el jenoma de S. sclerotiorum, qe l'era estremament simil a i proteine ​​de ossaloacetad acetilidrolasi (SsOAH) de l'Aspergillus. (PlOAH) en termin de analìs funziunal, dumini cunservà e topologia. Curiosamente, l'adizion de L-ornitina a'l mez de brod de destrosa de patate (PDB) l'ha diminuid signifegadivament l'espression del jen SsOAH ind i miceli de S. sclerotiorum. Inscì, l’aplicaziun esogena de L-ornitina g’ha diminuì en mod significatif l’espresiun del jen SsOAH en i miceli füngich cattà sü di piant tratà. Finalment, l’aplicaziun de L-ornitina g’ha diminuì significativament la secreziun de acid ossalich in del mez PDB e in di fœui infettà. En conclusiun, la L-ornitina giœuga una funziun fundamental in del manteniment del stat de ossid-reduziun e anca in del mejorar la rispòsta de difesa di piant infettà. I resultà de chestu stüdi pœden vuttà a sviluppar metud innuvatif e ecologich per cuntrular la muffa bianca e mitigar sò impatt sü la produziun di fasol e sü olter cültür.
La muffa bianca, causada del fùngh necrotròfich Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, l’è una malatia devastant che reduss la resa che la rapresenta una seri minaccia per la produziun global de fasol (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). La sclerotinia sclerotiorum l’è un di patogen vegetai fùngich traspurtà del sœul püsee dificil de cuntrular, cunt un vast interval de ospit de püsee de 600 spècc vegetai e la capacità de macerar rapidament i tessü ospit en mod minga specifich (Liang e Rollins, 2018). En cundiziun minga favorevul, subìs una fas critich del sò cìclo vital, restand dormient per luungh periud de temp cuma strütür neger, duur e simil a sèm ciamà “sclerozia” in del sœul o cuma cressita bianch e spugnos in del miceli o in del stel di piant infettà (alwart et20). El S. sclerotiorum l’è bon de formar sclerotie, qe al ge permet de soraviver ind i camp infetads per periods de temp long e de persistir durant la malatia (Schwartz et al., 2005). I scleroti sun richi de nutrient, pœden persistir in del sœul per luungh periud e servir cuma inocul primari per i infeziun sucesif (Schwartz et al., 2005). En cundiziun favurevul, i scleroti germinan e produsen spore trasportà en aria che pœden infetar tüt i part fuoriterra de la pianta, anca ma minga limità ai fiur, ai stèl o ai baccell (Schwartz et al., 2005).
La sclerotinia sclerotiorum dupera una strategia a plü livei per infetar i sò piant ospit, coinvolgend una seri de event cuurdinà de la germinaziun sclerotial al svilupp di sintom. Inizialment, el S. sclerotiorum produss spore suspenduu (ciamà ascospore) de strütür simil a fungh ciamà apotecia, che se trasportan en aria e se sviluppan en scleroti minga motil süi detriti vegetai infettà (Bolton et al., 2006). El fùngh secern pœu acid ossàlich, un fatur de virulenza, per cuntrular el pH de la pared celùlar di piant, favorir la degradasiun enzimatich e l’invasiun di tessü (Hegedus e Rimmer, 2005), e suprimer l’esplosiun ossidativa de la pianta ospit. Chestu prucess de acidificaziun indeboliss la pared celùlar di piant, furnend un ambient favorevul per el funziunament nurmal e eficient di enzimi degradant la pared celùlar fùngich (CWDE), cunsentend al patogen de superar la barriera fisich e de penetrar en i tessü ospit (Marciano et al., 1983). Una vœlta penetrad, el S. sclerotiorum al secern un cert numer de CWDE, comè la poligalaturonasi e la cellulasi, qe faciliten la soa difusion ind i tessuds infetads e i causen la necrosi dei tessuds. La progression dei lesion e dei tappets ifai la porta ai sintom carateristeg del muff bianc (Hegedus e Rimmer, 2005). Intant, i piant ospit recugnusen i mudei molecùlari asocià ai patogen (PAMP) travers i recetur de recognusiment di mudei (PRR), scatenant una seri de event de segnalaziun che a la fin ativan i rispost de difesa.
Nonostant desènn de sforzi per el cuntrol di malatie, la carenza de germoplasma resistent adeguà resta in di fasol, cuma en olter cültür cumerciai, dovüda a la resistenza, a la soravivenza e a l’adatabilità del patogen. La gestiun di malatie l’è donca estremament dificil e la dumanda una strategia integrada e a plü facc che cumprend una cumbinaziun de prategh cültürai, cuntrol biologich e fungicida chimich (O’Sullivan et al., 2021). El cuntrol chimich del muff bianch l’è el püsee eficaz perché i fungicida, se aplicà en mod giüst e in del mument giüst, pœden cuntrular eficacement el diffonder de la malatia, redüss la gravità del infeziun e minimizzar i pèrt de resa. Però, l’üs esagerà e la eccessiva dipendenza di fungicida pœden purtà a la cressita de cep resistent de S. sclerotiorum e avegh un impatt negatif süi urganism minga miraa, sü la salud del sœul e sü la qualità del aqua (Le Cointe e olter, 2016; Ceresini e olter, 2024). Donca, truvar alternatif ecologich l’è diventà una priorità massima.
I poliamin (PA), cuma la putrescina, la spermidina, la spermina e la cadaverina, pœden servir cuma alternatif promettent cuntra i patogen di piant traspurtà in del sœul, reducend inscì cumpletament o parzialment l’üs di fungicida chimich periculus (Nehela e olter, 2024; Yi20 e olter, 2). En i piant superiur, i PA sun coinvolt en tanti prucess fisiologh cuma, ma minga limità a, la divisiun celùlar, la diferenziazziun e la rispòsta ai stress abiotich e biotich (Killiny e Nehela, 2020). Pœden agir comè antiossidants, vutar a scavar via i spece de ossijen reativ (ROS), a mantegnir l'omeostasi de ossid-reduzion (Nehela e Killiny, 2023), indur jen ligads a la difesa (Romero e coll., 2018), regolar varie vie metabolege modulade (Nehela e Killiny2, 20). Killiny, 2019), stabilir una resistenza acquisida sistemich (SAR) e regulamentar i interaziun piant-patogen (Nehela e Killiny, 2020; Asija e alter, 2022; Czerwoniec, 2022). Vale la pena notar che i mecanism specifich e i funziun di PA in de la difesa di piant varian a segond di spècc di piant, di patogen e di cundiziun ambientai. La PA püsee abundant en i piant l’è biosintetizada de la poliamina esenzial L-ornitina (Killiny e Nehela, 2020).
La L-ornitina giœuga plü funziun in de la cressita e in del svilupp di piant. Par esempi, stüdi precedent g’han mustrà che in del ris (Oryza sativa), l’ornitina pœu vèss asocià al riciclagg del azot (Liu e coll., 2018), a la resa del ris, a la qualità e al aroma (Lu e coll., 2020) e a la rispòsta al stress idrich (Yang e coll., 2000). Ancamò, l’aplicaziun esogena de L-ornitina g’ha mejorà en mod significatif la toleranza a la siccità in de la barbabietola (Hussein et al., 2019) e g’ha mitigà el stress sal in de la scigùla (Allium Cepa) Rocha e olter, 2012). El rœul putenzial de la L-ornitina in de la difesa contra el stress abiotich pœu vèss dovüu a sò coinvolgiment in del accumul de prolina en i piant tratà. Per esempi, i jen ligads a'l metabolism de la prolina, comè i jen de l'aminotrasferasi delta de l'ornitina (delta-OAT) e de la prolina desidrojenasi (ProDH1 e ProDH2), inn staits segnalads in precedenza comè coinvoljuds ind la difesa de la bentamina e de l'arabidopsis taliana contra i Pse miga ospit. Misur, 2012). D’oltra part, l’ornitina decarbossilasi fùngina (ODC) l’è necesaria per la cressida del patojen (Singh et al., 2020). Mirar l'ODC del Fusarium ossispor f. sp. licopersi a travers del silenziament genich induù del ospit (HIGS) g’ha mejorà en mod significatif la resistenza di piant de tomates a la appassiva del Fusarium (Singh et al., 2020). Però, el ròll putenzial del aplicaziun del ornitina esogen cuntra i stress biotich cuma i fitopatogen l’è minga stà ben stüdià. Plussee important, i efets de l'ornitina su la resistenza ai malatie e i fenomen bioqimeg e fisiolojeg associads resten per la plupart miga esplorads.
Cumprender la cumplessità del infeziun S. sclerotiorum di legumi l’è impurtant per el svilupp di strategì de cuntrol eficach. En chestu stüdi, vorém identificar el ròll putenzial de la diamina L-ornitina cuma fatur ciave per rafurzar i mecanism de difesa e la resistenza di piant legumi a l’infeziun de sclerotinia sclerotiorum. Pensem che, olter a mejorar i rispost de difesa di piant infettà, la L-ornitina giœuga anca un rœul fundamental in del manteniment del stat de ossid-reduziun. Proponom qe i efets potenziai de la L-ornitina inn ligads a la regolazion dei mecanism de difesa antiossidant enzimateg e miga enzimateg e a l'interferenza cont i fator de patojeneitaa/virulenza dei fonj e ai proteine ​​associade. Chesta dual funziunalità de L-ornitina la rend un candidà prometent per una strategia sostenibil per mitigar l’impatt del muff bianch e mejorar la resistenza di cültür de legumi comun a chestu putent patogen fùngich. I resultà del present stüdi pœden vuttà al svilupp di metud innuvatif e ecologich per cuntrular la muffa bianca e mitigar sò impatt sü la produziun de legum.
In qest studi, una varietaa comerçalla suscetibil de fasol comun, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ‘l é staita drovada coma material sperimental. I sèm san sun stà gentilment furnì del Dipartiment de Ricerca süi Legumi, del Istitut de Ricerca süi Coltür del Camp (FCRI), del Centro de Ricerca Agricula (ARC), Egitt. Cinq sèm sun stà seminà en vasi de plastica (diameter interno 35 cm, prufondità 50 cm) riempì de sœul infettà de S. sclerotiorum en cundiziun de serra (25 ± 2 °C, ümidità relatif 75 ± 1%, 8 h lüs/16 h scür). A 7-10 dì dopu la semina (DPS), i piantin sun stà diminuì per lassar sultant dü piantin cunt una cressita uniform e tri fœui cumpletament espandüu en ogni vas. Tüt i piant en vas sun stà annagà una volta ogni dü seteman e fecundà tüt i mes a la velocità racumandada per la varietà specifica.
Per preparar una cuncentraziun de 500 mg/L de L-ornitinidiamina (cognusuuda anca cuma acid (+)-(S)-2,5-diaminopentanoich; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), 50 mg sun stà prima dissolt in 100 mL de aqua distilada steril. La soluziun de riserva l’è stada pœu diluida e duperada en esperiment sucesif. En curt, sun stà testà in vitro ses seri de cuncentraziun de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L). Ancamò, l’aqua distilada steril l’è stada duperada cuma cuntrol negatif (Mock) e fungicida cumercial “Rizolex-T” en polvar umidificabil al 50% (toclofos-metil 20% + tiram 30%; üs de pesticida e sustanz chimich KZ-Kafr El Zayat, Kaf) cuma cuntrol pusitif. El fungicida cumercial “Rizolex-T” l’è stà testà en vitro a ciinch cuncentraziun (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L).
I campiun de stèl e baccell de fasol comun che mustravan sintom tipich de muff bianch (tass de infeziun: 10-30%) sun stà cattà sü di fattorie cumerciai. Anca se la magiur part di materiai vegetai infettà sun stà identificà per spècc/varietà (varietà cumercial suscetibil Giza 3), olter, en particular quei ottenü di mercà locai, l’eran de spècc minga cognusuu. I materiai infettà cattà sü sun stà prima disinfettà en superfiss cunt una soluziun de ipoclorit de sodi al 0,5% per 3 minut, dopu sciacquà tanti volt cun aqua distilada steril e asciugà a secc cun carta filter steril per scancelà l’aqua eccessiva. I orgen infetà sun stà pœu tajà en pezz piscinin del tessü medi (intra tessü san e infetà), cultivà sü mez agar de destrosa de patat (PDA) e incubà a 25 ± 2 °C cunt un ciclo lüs de 12 h/12 ​​h scür per 5 dì per stimular la formaziun de la sclerotia. El metud de la punta micelial l’è stà anca duperà per purificà i isulà füngich de cültür mist o cuntaminài. L’isolà fùngich purificà l’è stà prima identificà sü la bas di sò carateristich morfologich cültürai e dopu cunfermà cuma S. sclerotiorum sü la bas di carateristich microscopich. Finalment, tüt i isulà purificà sun stà testà per la patogenicità sü la cültivar de fasol comun suscetibil Giza 3 per sudisfar i postulà de Koch.
De soraplu, l'isolad plussee invasiv de S. sclerotiorum (isolad #3) l'è stait ulteriorment confermad su la bas del sequenziament del spaziador trascrit intern (ITS) comè descrivud de White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. En curt, i isulà sun stà cultivà en brou de destrosa de pòmm de terra (PDB) e incubà a 25 ± 2 °C per 5-7 dì. El miceli füngich l’è stà pœu cattà sü, filtrà travers de la tela de formagg, lavà dü volt cun aqua steril e secà cun carta filtrada steril. L’ADN jenomeg l’è stait isolad cont l’utilizar el kit de minipreparazion fœngica/baterega Quick-DNATM (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La rejon del rDNA ITS l’è staita pœ amplificada cont l’utilizar la cobia specifega de iniziador ITS1/ITS4; dimension prevista: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). I prudot PCR purificà sun stà sometü per el sequenziament (Compagnia de biotecnologia de Pechin Aoke Dingsheng). I sequenze de rDNA ITS inn staite sequenziade bidirezionalment cont el metod de sequenziament de Sanger. I sequenz de dumanda assemblà sun stà pœu cunfruntà cunt i ültem dati en GenBank e en el Centr Naziunal per l’Informaziun Biotecnologich (NCBI) duperand el software BLASTn. La sequenza de la dumanda l’è stada cunfruntada cun 20 olter cep/isulà de S. sclerotiorum recuperà di ültem dat in de la GenBank NCBI (Tabela suplementar S1) duperand ClustalW in del pachett de analìs de genetich evolutif molecùlar (MEGA-11; versiun 11) (Kumar et al., 20). L'analisi evolutiva l'è staita faita cont el metod de la massima probabilitaa e el modell jeneral de sostituzion dei nucleotids reversibel ind el temp (Nei e Kumar, 2000). L’è mustrà l’arbur cun la püsee volta probabilità de log. L’arbur inizial per la ricèrca euristich l’è seleziunà scernind l’arbur cun la magiur probabilità de log intra l’arbur de junziun visin (NJ) (Kumar et al., 2024) e l’arbur de parsimonia massima (MP). L’arbur NJ l’è stà costruì duperand una matris de distanza en coppi calculada duperand el mudel general riversibil in del temp (Nei e Kumar, 2000).
L’atività antibaterich de L-ornitina e del batericida “Rizolex-T” l’è stada determinada in vitro cunt el metud de difusiun de agar. Metod: Prender la quantità giüsta de la soluziun de riserva de L-ornitina (500 mg/L) e mes’ciarla ben cun 10 ml del mez nutritif PDA per preparar soluziun cun cuncentraziun final de rispettivament 12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L. Cuma cuntrol sun stà duperà ciinch cuncentraziun del fungicida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L) e aqua distilada steril. Dopu che el medium s’è solidificà, un tapp micelial preparà de cültür de Sclerotinia sclerotiorum, de 4 mm de diameter, l’è stà trasferì al center del plat de Petri e cultivà a 25±2°C fin quand el miceli g’ha cupert tüt el plat de Petri de cuntrol, dopu che l’è stada registrada la cressita fùngich. Calcula la percentual de inibiziun de la cressita radial de S. sclerotiorum duperand l’equaziun 1:
L’esperiment l’è stà ripetù dü volt, cun ses copi biologich per ogni grupp de cuntrol/sperimental e ciinch vasi (dü piant per vasi) per ogni copi biologich. Ogni repli biologich l’è stà analizà dü volt (dü repli tecnich) per garantir l’acürateza, l’afidabilità e la riproducibilità di resultà sperimentai. Ancamò, l’analìs de regresiun probit l’è stada duperada per calculà la cuncentraziun inibitur mità massima (IC50) e IC99 (Prentice, 1976).
Per valutar el putenzial de la L-ornitina en cundiziun de serra, sun stà fatt dü esperiment en vas consecutif. En curt, i vasi sun stà riempì cun sœul argillosa-sabla sterilizà (3:1) e inoculà cunt una cültüra preparada de S. sclerotiorum. Prim, l’isolà püsee invasif de S. sclerotiorum (isolà n.3) l’è stà cultivà tajand un sclerotio a mità, mettend-l cun la facia giò sü un PDA e incuband a 25°C en scürità custant (24 h) per 4 dì per stimular la cressita micelial. Quater tapp de agar de diameter 5 mm sun stà pœu prelevà del bord principal e inoculà cun 100 g de una mescüla steril de frument e crusca de ris (1:1, v/v) e tüt i pacch sun stà incubà a 25 ± 2 °C sotta un ciclo de 12 h lüs/12 h scür per stimolar per 5. El contenuu de tüt i pacch l’è stà ben mes’cià per garantir l’omogeneità prima de giuntà sœul. Donca, 100 g de la mistura de crusca colonizant sun stà giuntà a ogni vas per garantir una cuncentraziun custant de patogen. I vasi inoculà sun stà annagà per ativar la cressita di füngh e mettuu en cundiziun de serra per 7 dì.
Cinq somenze de la varietaa de Giza 3 a i henn staite pœ semenade in çascun vas. Per i vasi tratà cun L-ornitina e el fungicida Rizolex-T, i sèm sterilizà sun stà prima bagnà per dü o en una soluziun aquosa di dü cumpost cunt una cuncentraziun final de IC99 rispettivament de circa 250 mg/L e 50 mg/L, e dopu secc a l’aria per un ura. D’oltra part, i sèm sun stà bagnà en aqua distilada steril cuma cuntrol negatif. Dopu 10 dì, prima de la prima annada, i piantin sun stà diluì, lassand sultant dü piantin cürt en ogni vas. Ancamò, per garantir l’infeziun cun S. sclerotiorum, i stèl di piant de fasol in del stess stadi de svilupp (10 dì) sun stà tajà en dü posiziun diferent duperand un bisturi sterilizà e circa 0,5 g de la mescüla de crusca colonizant sun stà mettuu en ogni ferida, seguì de volta ümidità per sviluppar tüt i malatie. I piant de cuntrol sun stà ferì en mod simil e una quantità istesss (0,5 g) de mescüla de crusca steril e minga colonizà l’è stada metüda in de la ferida e mantegnuuda sotta volta ümidità per simular l’ambient per el svilupp di maladì e garantir la coerenza intra i grupp de tratament.
Metud de tratament: i piantin de fasol sun stà annagà cun 500 ml de soluziun aquosa de L-ornitina (250 mg/l) o del fungicida Rizolex-T (50 mg/l) irrigand el sœul, dopu el tratament l’è stà ripetù tri volt a un interval de 10 dì. I cuntrol tratà cun placebo sun stà irrigà cun 500 ml de aqua distilada steril. Tüt i tratament sun stà fatt en cundiziun de serra (25 ± 2°C, 75 ± 1% de ümidità relatif e un fotoperiod de 8 h lüs/16 h scür). Tüt i vasi sun stà annagà tüt i quindes e tratà tüt i mes cunt un ledamm NPK bilancià (20-20-20, cun 3,6% de solfar e microelement TE; Zain Seeds, Egitt) a una cuncentraziun de 3-4 g/l cun spruzzadura foliar segond i racomandaziun per la varietà specifich del produtur. A men che l’è minga indicà altriment, i fœui madür cumpletament espandü (segond e terz fœui de volt) sun stà cattà sü de ogni replich biologich a 72 h dopu el tratament (hpt), omogeneizà, mettü insema e cunservà a -80 °C per olter analìs cuma, ma minga limità a, per ossidaziun en situ indicaziun, per ossidaziun istochimich. e antiossidants miga enzimateg e espresion jenega.
L’intensità del infeziun del muff bianch l’è stada valutada tüt i settman 21 dì dopu l’inoculaziun (dpi) duperand una scäla de 1-9 (Tabela suplementar S2) basà sü la scäla de Petzoldt e Dickson (1996) mudificà de Teran et al. (2006). En curt, i stèl e i ram di piant de fasol sun stà esaminà a partir del punt de inoculaziun per seguir la progresiun di leziun luungh internodi e nodi. La distanza de la lesion dal punt de inoculaziun al punt püsee luntan luungh el stel o el ram l’è stada pœu mesürada e l’è stà asegnà un puntegg de 1-9 sü la bas de la posiziun de la lesion, induè (1) indicava nissuna infeziun visibil visin al punt de inoculaziun e (2-9) indicava un aument gradual de la dimensiun de la lesion a/S noudes e S2). L’intensità del infeziun del muff bianch l’è stada cunvertida en percentual duperand la formula 2:
Ancamò, l’area sotta la cürva de prugresiun de la malatia (AUDPC) l’è stada calculada duperand la furmula (Shaner e Finney, 1977), che l’è stada recentement adatada per la putrefaziun bianca del fasol comun (Chauhan et al., 2020) duperand l’equaziun 3:
Induè Yi = gravità de la malatia al mument ti, Yi+1 = gravità de la malatia al mument sucesif ti+1, ti = mument de la prima misuraziun (en dì), ti+1 = mument de la misuraziun sucesif (en dì), n = nümer total de punt de temp o punt de osservaziun. I parameter de la cressita di piant de fasol cuma l’alteza de la pianta (cm), el nümer de ram per pianta e el nümer de fœui per pianta sun stà registrà tüt i settman per 21 dì en tüt i repli biologich.
En ogni repli biologich, i campiun di fœui (segond e terz fœui cumpletament sviluppà de volt) sun stà cattà sü el dì 45 dopu el tratament (15 dì dopu l’ültem tratament). Ogni repli biologich l’era furmà de ciinch vasi (dü piant per vasi). Circa 500 mg del tessü sfracià sun stà duperà per l’estraziun di pigment fotosintetich (clorofila a, clorofila b e carotenoid) duperand l’80% de aceton a 4 °C al scür. Dopu 24 h, i campiun sun stà centrifugà e el süpernatant l’è stà cattà sü per la determinaziun del contenuu de clorofila a, clorofila b e carotenoid en mod colorimetrich duperand un spettrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Giapun) segond el metud de (misuraziun trio divers) luunghezz d’unda (A470, A646 e A663 nm). Per finì, el contenuu di pigment fotosintetich l’è stà calculà duperand i furmul 4-6 descrivuu de Lichtenthaler (1987).
A 72 h dopu el tratament (hpt), i fœui (segond e terz fœui cumpletament sviluppà de volt) sun stà cattà sü de ogni replich biologich per la localizaziun istochimich in situ del perossid de idrogen (H2O2) e del anion de superossid (O2•−). Ogni repli biologich l’era furmà de ciinch vasi (dü piant per vasi). Ogni repli biologich l’è stà analizà en dupli (dü repli tecnich) per garantir l’acürateza, l’afidabilità e la riproducibilità del metud. H2O2 e O2•− sun stà determinà duperand rispettivament el 0,1% de 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) o tetrazolio nitroblu (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), segund i metud descrivuu de Romeutas et alP. (2004) e Adam e coll. (1989) cun modifich minuri. Per la localizaziun istochimich de H2O2 in situ, i fogliet sun stà infiltrà a vœui cun 0,1% DAB en tampon Tris 10 mM (pH 7,8) e dopu incubà a temperadüra ambient a la lüs per 60 min. I fogliet sun stà sbiancà in del 0,15% (v/v) de TCA en etanol:cloroform 4:1 (v/v) (farmaceutich e fornitür medich Al-Gomhoria, Cair, Egitt) e dopu espost a la lüs fin quand se sun scüri. Inscì, i valvul sun stà infiltrà a vœui cun tampon de fosfat de putassi 10 mM (pH 7,8) che g’haveva denter 0,1 p/v % HBT per la localizaziun istochimich de O2•− in situ. I fogliet sun stà incubà a la lüs a temperadüra ambient per 20 min, dopu sbiancà cuma de sora e dopu illuminà fin quand sun cumpars di macchi blu scür/violett. L’intensità del culur marun (cuma indicadur de H2O2) o blu-violett (cuma indicadur de O2•−) che resulta l’è stada valutada duperand la versiun di Fiji del pachett de elaboraziun di imagen ImageJ (http://fiji.sc; access el 7 marz 2024).
El malondialdeid (MDA; cuma marcadur de perossidaziun lipidich) l’è stà determinà segond el metud de Du e Bramlage (1992) cun ligeri modifich. I fœui de ogni replich biologich (segond e terz fœui cumpletament sviluppà de volt) sun stà cattà sü 72 h dopu el tratament (hpt). Ogni replicà biologich includeva ciinch vasi (dü piant per vasi). Ogni repli biologich l’è stà analizà en dupli (dü repli tecnich) per garantir l’acürateza, l’afidabilità e la riproducibilità del metud. En curt, 0,5 g de tessü de fœuj terrester sun stà duperà per l’estraziun MDA cun acid tricloroacetich al 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, Stat Ünì) che g’ha denter el 0,01% de idrossitoluen butilà (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stat Ünì). El contenuu de MDA in del suranatant l’è stà pœu determinà colorimetricament mesurand l’assorbiment a 532 e 600 nm duperand un spettrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Giapon) e dopu espress cuma nmol g-1 FW.
Per la valutaziun di antiossidant minga enzimatich e enzimatich, i fœui (segond e terz fœui cumpletament sviluppà de volt) sun stà cattà sü de ogni repli biologich a 72 h dopu el tratament (hpt). Ogni repli biologich l’era furmà de ciinch vasi (dü piant per vasi). Ogni campiun biologich l’è stà analizà en duplicat (dü campiun tecnich). Dü fœui sun stà molà cun azot liquid e duperà diretament per la determinaziun di antiossidant enzimatich e minga enzimatich, di aminoacid total, del contenüu de prolina, del espresiun genich e de la quantificaziun del ossalat.
I fenolich solubil total sun stà determinà duperand el reagent Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, Stat Ünì) cun liger modifich al metud descrivuu de Kahkonen et al. (1999). En curt, circa 0,1 g de tessü de fœuj omogeneizà l’è stà estratt cun 20 ml de metanol al 80% al scür per 24 h e el süpernatant l’è stà cattà sü dopu la centrifugaziun. 0,1 ml del estratt del campiun l’è stà mes’cià cun 0,5 ml de reagent Folin-Ciocalteu (10%), scumbinà per 30 s e lassà al scür per 5 min. Poeu 0,5 ml de soluziun de carbonat de sodi al 20% (Na2CO3; Società farmaceutich e fornitür medich Al-Gomhoria, Cair, Egitt) sun stà giuntà a ogni tub, mes’cià ben e incubà a temperadüra ambient al scür per 1 h. Dopu l’incubaziun, l’assorbiment de la mistura de reaziun l’è stà mesurà a 765 nm duperand un spettrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Giapun). La cuncentraziun di fenol solubil total en i estratt campiun l’è stada determinada duperand una cürva de calibraziun del acid gallich (Fisher Scientific, Hampton, NH, Stat Ünì) e espress cuma miligramm de acid gallich equivalent per gramm de pes frèsch (mg GAE g-1 pes frèsch).
El contenüu total di flavonoid solubil l’è stà determinà segond el metud de Djeridane et al. (2006) cun liger modifich. En curt, 0,3 ml del estratt de metanol sora l’è stà mes’cià cun 0,3 ml de soluziun de clorur de aluminio al 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, Stat Ünì), mes’cià cun forza e dopu incubà a temperadüra ambient per 5 min, seguì del adiziun de soluziun de 0% de poceta. (Farmaceutich e fornitür medich Al-Gomhoria, Cair, Egitt), ben mes’cià e incubà a temperadüra ambient per 30 min al scüro. Dopu l’incubaziun, l’assorbiment de la mistura de reaziun l’è stà mesurà a 430 nm duperand un spettrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Giapun). La cuncentraziun di flavonoid solubil total en i estratt campiun l’è stada determinada duperand una cürva de calibraziun de rutina (TCI America, Portland, OR, Stat Ünì) e dopu espress cuma miligramm de rutina equivalent per gramm de pes frèsch (mg RE g-1 pes frèsch).
El contenuu total de aminoacid liber di fœui de fasol l’è stà determinà duperand un reagent de nindrina mudificà (Sustanz chimich termo scientifich, Waltham, MA, Stat Ünì) basà sul metud propost de Yokoyama e Hiramatsu (2003) e mudificà de Sun et al. (2006). En curt, 0,1 g de tessüt terrester sun stà estratt cun tampon a pH 5,4 e 200 μL del süpernatant sun stà reagit cun 200 μL de nindrina (2%) e 200 μL de copiridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), incubaa in un mesurà a 580 nm duperand un spettrofotometer UV-160A (Società Shimadzu, Giapun). D’oltra part, la prolina l’è stada determinada del metud Bates (Bates e coll., 1973). La prolina l’è stada estratta cun acid sulfosalicilich al 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Stat Ünì) e dopu la centrifugaziun, 0,5 ml del süpernatant l’è stà mes’cià cun 1 ml de acid acetich glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, Stat Ünì) e reagent de ninidrin co-asürà a 9°C e incu. a 520 nm duperand l’istess spettrofotometer de sora. I aminoacid liber total e la prolina en i estratt de fœui sun stà determinà duperand rispettivament cürvi de calibraziun de glicina e prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stat Ünì), e espress cuma mg/g de pes frèsch.
Per determinar l’atività enzimatich di enzimi antiossidant, circa 500 mg de tessü omogenizà sun stà estratt cun 3 ml de tampon Tris 50 mM (pH 7,8) che g’ha denter 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich; polilidroprich de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stat Ünì) e 7,5% Louis, MO, Stat Ünì), centrifugà a 10.000 × g per 20 min sotta refrigeraziun (4 °C), e el suranatant (estratt enzimatich grezz) l’è stà cattà sü (El-Nagar e olter, 2023; Osman e olter, 2023). La catalasa (CAT) l’è stada pœu reagida cun 2 ml de tampon de fosfat de sodi 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. 2023; Osman e olter, 2023). L’atività enzimatich de la perossidasi dipendent del guaiacol (POX) l’è stada determinada duperand el metud de Harrach et al. (2009). (2008) cun modifich minuri (El-Nagar e coll., 2023; Osman e coll., 2023) e l’atività enzimatich de la polifenol ossidasi (PPO) l’è stada determinada dopu la reaziun cun 2,2 ml de tampon de fosfà de sodi 100 mM (pH de guacol 6,0 l). Portland, OR, Stat Ünì) e 100 μl de H2O2 12 mM. El metud l’è stà un pooch mudificà de (El-Nagar e olter, 2023; Osman e olter, 2023). El test l’è stà fatt dopu la reaziun cun 3 ml de soluziun de catecol (Sustanz chimich termoscientifich, Waltham, MA, USA) (0,01 M) preparà de nov en tampon fosfà 0,1 M (pH 6,0). L’atività CAT l’è stada mesürada monitorand la decomposiziun de H2O2 a 240 nm (A240), l’atività POX l’è stada mesürada monitorand l’aument del assorbiment a 436 nm (A436) e l’atività PPO l’è stada mesürada registrand i fluttuaziun de assorbiment a 495 nm ogni min U30 a spettrofotometro (Shimadzu, Giapon).
La RT-PCR in temp real l’è staita drovada per rilevar i nivei de trascrizion de tri jen ligads ai antiossidants, intra quei la catalasa perossisomal (PvCAT1; n. de acession a la Banca dei Gen KF033307.1), la dismutasi de superossid (PvSOD; la glutioneBank n. XM_0686395). Accesiun n. KY195009.1), en fœui de fasol (la segonda e la terza fœui cumpletament sviluppada de volt) 72 h dopu l’ültem tratament. In curt, l’ARN l’è stà isulà duperand el kit de estraziun de ARN total Simply P (n. cat. BSC52S1; BioFlux, tecnologia Biori, Cina) segond el protocoll del produtur. Pœu, el cDNA l’è stà sintetizà duperand el Kit de sintès del cDNA TOP scriptTM segond i istruziun del produtur. I sequenze de primer dei tri jen sora inn elencade ind la Tabella Suplementar S3. La PvActina-3 (numer de adesion a la GenBank: XM_068616709.1) l’è staita drovada comè jen de manteniment e l’espression jenega relativa l’è staita calcolada cont el metod 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001). L’è stada dimustrada la stabilità del actina sotta stress biotich (interaziun minga cumpatibil intra i legum comun e el fùngh antracnosich) e el stress abiotich (siccità, salnità, bas temperadüra) (Borges et al., 2012).
Inizialment g’hem fatt un’analìs en silico a livell del genoma di prutein de ossaloacetà acetilidrolasi (OAH) en S. In curt, g’hem duperà OAH de Aspergillus fijiensis CBS 313,89 (AfOAH; tassida: 1191702; nümer de adesiun a la GenBank XP_040799428,1; 342 aminoacid) e Penicillium lagena (PlOAH2; tassida1Bank: 9; XP_056833920,1; 316 aminoacids) comè sequenze de domanda per mapar la proteina omologa in S. sclerotiorum (tassid: 5180). El BLASTp l’è stà fatt cuntra i dat del genoma de S. sclerotiorum püsee recentement dispunibel in de la GenBank sul sit web del Center Naziunal per l’Informaziun Biotecnologich (NCBI), http://www.
De soraplu, el jen OAH previst de S. sclerotiorum (SsOAH) e l'analisi evolutiva e l'arbor filojeneteg de AfOAH de A. fijiensis CBS 313,89 e del PlOAH de P. lagena inn staits deduts cont l'utilizar el metod de massima probabilitaa in matris Jmura1,21. mudel (Jones e olter, 1992). L'arbor filojeneteg l'è stait combinad cont l'analisi de allineament multipla dei sequenze proteige de tuts i jen OAH preveduds (SsOAH) de S. sclerotiorum e la sequenza de domanda cont el Strument de allineament basad sul vincol (COBALT; e Agarwala, 2007). Ancamò, i sequenz de aminoacid püsee curispundent de SsOAH de S. sclerotiorum sun stà allineà cunt i sequenz de dumanda (AfOAH e PlOAH) (Larkin et al., 2007) duperand ClustalW (sun stà allineà in de la regiun visualizà in del bin di strüment e allineà la regiun de conservaziun). Strument ESPript (versiun 3.0;
Ancamò, i domini rapresentatif funziunai previst e i sit cunservà de SsOAH de S. sclerotiorum sun stà clasificà en mod interatif en famèji diferent duperand el strüment InterPro (Blum et al., 2021). Finalment, la mudelaziun de la strütüra tridimensiunal (3D) del SsOAH previst de S. sclerotiorum l’è stada fada duperand el mutur de recogniziun de omologia/analogia proteich (versiun 2.0 del server Phyre2; 2015) e validà duperand el server SWISS-MODEL (Biasini e coll., 2014). I strütür tridimensiunai previst (furmà PDB) sun stà visualizà en mod interatif duperand el pachet UCSF-Chimera (versiun 1.15; chimera) (Pettersen et al., 2004).
La PCR quantitativa a fluorescenza in temp real l’è stada duperada per determinar el nivell de trascriziun del ossaloacetà acetilidrolasi (SsOAH; nümer de adesiun de la GenBank: XM_001590428.1) in di miceli de la sclerotinia. En curt, S. sclerotiorum l’è stà inoculà en un pacch che g’ha denter PDB e mettuu en un incubatur a scuoter (mudel: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Stat Ünì) a 25 ± 2 °C per 24 h a 150 rpm e en scürità custant) per stimular la cressita (24 h). Dopu, i celùl sun stà tratà cun L-ornitina e el fungicida Rizolex-T a cuncentraziun final de IC50 (rispettivament circa 40 e 3,2 mg/L) e dopu cultivà per olter 24 h en istess cundiziun. Dopu l’incubaziun, i cültür sun stà centrifugà a 2500 rpm per 5 min e el süpernatant (miceli fùngich) l’è stà cattà sü per l’analìs del espresiun genich. Inscì, el miceli füngich l’è stà cattà sü a 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h dopu l’infeziun di piant infettà che g’havevan furmà muff bianch e miceli de cutun sü la superfiss di tessü infettà. L'ARN l'è stait estrait del miceli funjen e pœ l'ADNc l'è stait sintetizad comè descrivud de sora. I sequenze de primer per SsOAH inn elencade ind la Tabella Suplementar S3. La SsActina (numer de adesion a la GenBank: XM_001589919.1) l’è staita drovada comè jen de manteniment e l’espression jenega relativa l’è staita calcolada cont el metod 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001).
L’acid ossàlich l’è stà determinà en brou de destrosa de pòmm de terra (PDB) e en campiun vegetai che g’han denter el patogen fùngich Sclerotinia sclerotiorum segond el metud de Xu e Zhang (2000) cun di ligeri modifich. In curt, i isulà de S. sclerotiorum sun stà inoculà en pacch che g’haveva denter PDB e dopu cultivà en un incubatur a scuoter (mudel I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Stat Ünì) a 150 rpm a 25 ± 2 °C per stimular la scüra custant. Dopu l’incubaziun, la cültüra füngich l’è stada prima filtrada travers de carta filtrada Whatman #1 e dopu centrifugada a 2500 rpm per 5 min per scancelà el micelio residuo. El suranatant l’è stà cattà sü e cunservà a 4°C per un’oltra determinaziun quantitativa del ossalato. Per la preparaziun di campiun vegetai, circa 0,1 g de framment de tessüt vegetai sun stà estratt tri volt cun aqua distilada (2 ml ogni volta). I campiun sun stà pœu centrifugà a 2500 rpm per 5 min, el süpernatant l’è stà filtrà a secc travers del carta de filter Whatman n. 1 e cattà sü per ulterior analìs.
Per l’analìs quantitativa del acid ossalich, la mistura de reaziun l’è stada preparada en un tub tappà de veder in del urden seguent: 0,2 ml de campiun (o filtrà de cültüra PDB o soluziun standard de acid ossalich), 0,11 ml de blu bromofenol (BPB, 1 mM; acid (H2SO4; farmaceutich e fornitür medich Al-Gomhoria, Cair, Egitt) e 0,176 ml de dicromà de putassi 100 mM (K2Cr2O7; sustanz chimich TCI, Portland, OR, Stat Ünì), e dopu la soluziun l’è stada diluida en mod vigoros, cun 4,8 ml de dicrom de putassi en un bagn d’aqua a 60 °C. Dopu 10 min, la reaziun l’è stada fermada giuntant 0,5 ml de soluziun de idrossid de sodi (NaOH; 0,75 M). L’assorbiment (A600) de la mistura de reaziun l’è stà mesurà a 600 nm duperand un spettrofotometer UV-160 (Shimadzu Corporation, Giapun). PDB e aqua distilada sun stà duperà cuma cuntrol per la quantificaziun rispettivament di filtrà de cültüra e di campiun vegetai. I cuncentraziun de acid ossàlich en i filtrà de cültür, espress cuma microgramm de acid ossàlich per mililitr de mez PDB (μg.mL-1), e en i estratt de fœuj, espress cuma microgramm de acid ossàlich per gramm de pes frèsch (μgg-1 FW), sun stà determinà duperand una calibraziun de acid ossàlich curvecifich, la calibraziun de acid osàlich S, MA, Stati Ünì).
Durant tüt el stüdi, tüt i esperiment sun stà prugetà en un pruget cumpletament randumizà (CRD) cun ses copi biologich per tratament e ciinch vasi per copi biologich (dü piant per vasi), a men che l’è indicà altriment. I copi biolojeg inn staits analizads in duplicad (du copi tecneg). I copi tecnich sun stà duperà per cuntrular la riproducibilità del stess esperiment ma sun stà minga duperà in del analìs statistich per evitar copi falsi. I dat sun stà analizà statisticament duperand l’analìs de varianza (ANOVA) seguida del test de diferenza onestament significatif (HSD) de Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Per i esperiment in vitro, sun stà calculà i valur IC50 e IC99 duperand el mudel probit e sun stà calculà i intervai de fiducia al 95%.
Un total de quater isulà sun stà cattà sü di diferent camp de soia in del guvernatur de El Ghabiya, en Egitt. Sü mez PDA, tüt i isulà g’han prodott un miceli bianch cremos che l’è diventà rapidament bianch de cutun (Figura 1A) e dopu beij o marun in del stadi del scleroti. I scleroti inn jeneralment dens, neger, sfereg o de forma iregolar, long de 5,2 a 7,7 mm e de diameter de 3,4 a 5,3 mm (Figura 1B). Anca se quater isulà g’han sviluppà un mudel marginal de sclerotia al bord del mez de cültüra dopu 10-12 dì de incubaziun a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), el nümer de sclerotizi per placa l’era significativament diferent intra luur (P < 0,001), cunt el nümer püsee volt de ha33a). 1,53 scleroti per placa; Fig. 1C). Inscì, l’isùlà n.3 g’ha prudott püsee acid ossalich en PDB rispett a olter isulà (3,33 ± 0,49 μg.mL-1; Fig. 1D). L’isolament n.3 g’ha mustrà carateristich morfologich e microscopich tipich del fùngh fitopatogen Sclerotinia sclerotiorum. Par esempi, sül PDA, i coloni del isulà n.3 cressevan rapidament, l’eran bianch cremos (Figura 1A), beige invers o giall-marun salmun ciair, e g’havevan bisogn de 6-7 dì a 25 ± 2°C per cuprir cumpletament la superfiss de una placa de diameter 9 cm. In su la bas dei carateristege morfolojege e microscopege sora, l'isolad n.3 l'è stait identifegad comè sclerotinia sclerotiora.
Figura 1. Carateristich e patogenità di isulà de S. sclerotiorum di cültür de legum comun. (A) Cressita micelial de quater isulà de S. sclerotiorum sü mez PDA, (B) sclerotia de quater isulà S. sclerotiorum, (C) nümer de sclerotio (per placa), (D) secreziun de acid ossàlich sü mez PDB (μg.mL-1) e (E) sclerotizi sü mez PDB (μg.mL-1) e (E) sclerotizi sü mez PDB (μg.mL-1) cültivar de legumi cumerciai suscetibil Giza 3 en cundiziun de serra. I valur rapresentan la media ± DS de ciinch copi biologich (n = 5). Letter diferent indican diferenzi statisticament significatif intra i tratament (p < 0,05). (F-H) I sintom tipich de muff bianch sun cumpars rispettivament süi stèl e süi silici sü la terra, 10 dì dopu l’inoculaziun cun isulà n.3 (dpi). (I) L’analis evolutiva de la regiun del spaziatur trascritt intern (ITS) del isulà de S. sclerotiorum n.3 l’è stada fada duperand el metud de massima verosimiglianza e cunfruntada cun 20 isulà/cep de riferiment ottenü dal database del Centro Naziunal per l’Informaziun Biotecnologich (NCBI). I numer sora i linee de raggruppament indican la copertura de la regiun (%) e i numer sotta i linee de raggruppament indican la luungheza del ram.
Ancamò, per cunfermar la patogenità, quater isulà de S. sclerotiorum ottenü sun stà duperà per inocular la cültivar de fasol cumercial suscetibil Giza 3 en cundiziun de serra, che l’è coerent cunt i postulà de Koch (Fig. 1E). Anca se tüt i isulà füngich ottenü l’eran patogen e pudevan infetar el fasol verd (cv. Giza 3), causand sintom tipich de muff bianch sü tüt i part al di sü de la terra (Fig. 1F), en particular süi stèl (Fig. 1G) e süi baccell (inoculaziun) al massim (Fig. 1H) l’è stà al massim el 10 isulà agresif en dü esperiment indipendent. L’isolà 3 g’haveva la gravità de la malatia püsee volta (%) süi piant de fasol (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 e 76,7 ± 3,1 rispettivament ai 7, 14 e 21 dì dopu l’infeziun; Figura 1F).
L’identificazion de l’isolad plussee invasiv de S. sclerotiorum #3 l’è staita ulteriorment confermada su la bas del sequenziament del spaziador trascrit intern (ITS) (Fig. 1I). L'analisi filojenetega intra l'isolad #3 e 20 isolads/cep de riferiment l'ha mostrad una volta someianza (>99%) intra lor. Vale la pena notar qe l'isolad S. sclerotiorum n.3 (533 pb) al g'ha una volta someianza a l'isolad amerigan de S. sclerotiorum LPM36 isolad de sèm de erbion sec (numer de acession a la GenBank MK896659.1; 540 pb) e el numer de S. OR206374,1; 548 pb), che causa la putrefaziun del stel violett (Matthiola incana), tüt ragruppà separà in de la part superiur del dendrogramm (Figura 1I). La nœva sequenza l’è staita depositada ind el database NCBI e l’è staita ciamada “Sclerotinia sclerotiora – isolad YN-25” (numer de adesion a la GenBank PV202792). Se pœl veder qe l'isolad 3 l'è l'isolad plussee invasiv; donca, chestu isulà l’è stà scelt per el stüdi en tüt i esperiment sucesif.
L’atività antibaterich de la diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) a cuncentraziun diferent (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) cuntra l’isòlà 3 de S. sclerotiorum l’è stada indagada en vitro. L’è degn de notar qe la L-ornitina l’ha esercitad un efet antibatereg e l’ha inibid gradualment la cressida radial dei ife de S. sclerotiorum ind una manera dipendenta de la dosi (Figura 2A, B). A la cuncentraziun püsee volta testà (125 mg/L), la L-ornitina g’ha dimustrà el tass de inibiziun de la cressita micelial püsee volt (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), che l’era equivalent al fungicida cumercial testà Rizolex-T (cuncentraziun püsee volt 99,2%; (10 mg/L), che indica un’eficacia simil.
Figura 2. Ativitaa antibaterega in vitro de la L-ornitina contra la sclerotina. (A) Cunfrunt del atività antibaterich di diferent cuncentraziun de L-ornitina cuntra S. sclerotiorum cunt el fungicida cumercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tass de inibiziun (%) de la cressita micelial de S. sclerotiorum dopu el tratament cun diferenti cuncentraziun de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) o Rizolex-T (rispettivament 2, 4, 6, 8/10 mg). I valur rapresentan la media ± DS de ciinch copi biologich (n = 5). Letter diferent indican diferenzi statistich intra i tratament (p < 0,05). (D, E) Analìs de regresiun del mudel Probit rispettivament de L-ornitina e fungicida cumercial Rizolex-T. La linea de regresiun del mudel probit l’è mustrada cuma una linea blu solida e l’interval de fiducia (95%) l’è mustrà cuma una linea ross trategiada.
Ancamò, l’è stada fada l’analìs de regresiun probit e i grafich curispundent sun mustrà in de la Tabela 1 e in di Figur 2D,E. En curt, el valur de pendenza acetabil (y = 2,92x − 4,67) e i statistich significatif asocià (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 e p < 0,0001; figüra 2D) del L-ornitina cunfruntà un antiatività cumercial cunfruntà. fungicida Rizolex-T (y = 1,96x - 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 e p < 0,0001) (Tabela 1).
Tabela 1. Valur de la cuncentraziun inibitur metà massima (IC50) e IC99 (mg/l) de L-ornitina e de fungicida cumercial “Rizolex-T” cuntra S. sclerotiorum.
In del cumpless, la L-ornitina (250 mg/L) g’ha redut en mod significatif el svilupp e la gravità del muff bianch süi piant de fasol comun tratà rispett ai piant infettà de S. sclerotiorum minga tratà (cuntrol; figüra 3A). En curt, anca se la gravità de la malatia di piant de cuntrol infettà minga tratà l’è aumentada gradualment (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 e 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina g’ha redut significativament la gravità de la malatia (%) durant tüt l’esperiment (8,7 ± 0,0). 1,00 e 26,36 ± 3,07) rispettivament ai 7, 14 e 21 dì dopu el tratament (dpt) (Figura 3A). Inscì, quand che i piant de fasol infettà de S. sclerotiorum sun stà tratà cun 250 mg/L L-ornitina, l’area sotta la cürva de prugresiun de la malatia (AUDPC) l’è diminuida de 1274,33 ± 33,13 in del cuntrol minga tratà a 281,03 ± 7,95 mg pusitif de chel cuntrol s. Fungicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). L’istess tendenza l’è stada osservà in del segond esperiment.
Fig. 3. Effet del aplicaziun esogen de L-ornitina sül svilupp de la putrefaziun bianca del fasol comun causada de Sclerotinia sclerotiorum en cundiziun de serra. (A) Curva de progresiun de la malatia del muff bianch de fasol comun dopu el tratament cun 250 mg/L de L-ornitina. (B) Area sotta la cürva de prugresiun de la malatia (AUDPC) de muff bianch de fasol comun dopu el tratament cun L-ornitina. I valur rapresentan la media ± DS de ciinch copi biologich (n = 5). Letter diferent indican diferenzi statisticament significatif intra i tratament (p < 0,05).
L’aplicaziun esogen de 250 mg/L L-ornitina g’ha aumentà gradualment l’alteza de la pianta (Fig. 4A), el nümer di ram per pianta (Fig. 4B) e el nümer di fœui per pianta (Fig. 4C) dopu 42 dì. Menter el fungicida cumercial Rizolex-T (50 mg/L) g’ha avü el magiur effet sü tüt i parameter nutriziunai stüdià, l’aplicaziun esogena de 250 mg/L de L-ornitina g’ha avü el segond effet püsee grand rispett ai cuntrol minga tratà (Fig. 4A-C). D’oltra part, el tratament cun L-ornitina g’ha minga avü un efet significatif sul contenüu di pigment fotosintetich clorofila a (Fig. 4D) e clorofila b (Fig. 4E), ma g’ha aumentà un pò el contenuu total de carotenoid (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) rispett al cuntrol negatif (0. cuntrol pusitif (0,46 ± 0,02 mg/g in pes; Fig. 4F). In del cumpless, chesti resultà indican che la L-ornitina l’è minga fitotossich per i legumi tratà e la pœu anca stimular luur cressita.
Fig. 4. Effet del aplicaziun esogen de L-ornitina süi carateristich de cressita e süi pigment fotosintetich di fœui de fasol infettà de Sclerotinia sclerotiorum en cundiziun de serra. (A) Alteza de la pianta (cm), (B) Numer de ram per pianta, (C) Numer de fœui per pianta, (D) Contenut de clorofila a (mg g-1 pes), (E) Contenut de clorofila b (mg g-1 pes), (F) Contenut total de carotenoid (mg g-1 fr). I valur sun la media ± DS de ciinch copi biologich (n = 5). Letter diferent indican diferenzi statisticament significatif intra i tratament (p < 0,05).
La localizaziun istochimich in situ di spècc de ossigen reatif (ROS; espress cuma perossid de idrogen [H2O2]) e di radical liber (espress cuma anion de superossid [O2•−]) g’ha rivelà che l’aplicaziun esogena de L-ornitina (250 mg/L) g’ha redut en mod significatif l’accumul de H,500. nmol.g−1 FW; Fig. 5A) e O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) rispett al accumulo di tüt i dü piant infettà minga tratà (173,31 ± 12,06) e 149,35 ± 7,94 nmol aspett e W. mg/L del fungicida cumercial Rizolex-T (rispettivament 170,12 ± 9,50 e 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr in peso) a 72 h. Nivei volt de H2O2 e O2•− accumulà sotta hpt (Fig. 5A, B). Inscì, el test de malondialdeid (MDA) basà sü TCA g’ha mustrà che i piant de fasol infettà de S. sclerotiorum g’han acümulà nivell püsee volt de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) en luur fœui (Fig. 5C). Però, l’aplicaziun esogen de L-ornitina g’ha redut en mod significatif la perossidaziun lipidich cuma dimustrà de la diminuziun del contenuu de MDA en i piant tratà (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effet del aplicaziun esogen de L-ornitina süi marcadur principai del stress ossidatif e süi mecanism de difesa antiossidant minga enzimatich en i fœui de fasol infetà cun S. sclerotiorum a 72 h dopu l’infeziun en cundiziun de serra. (A) Perossido di idrogeno (H2O2; nmol g-1 FW) a 72 cv, (B) anion superossido (O2•-; nmol g-1 FW) a 72 cv, (C) malondialdeide (MDA; nmol g-1 FW) a 72 cv, (D) fenoli solubili totali a 72 cv g-1 (E) flavonoid solubil total (mg RE g-1 FW) a 72 cv, (F) aminoacid liber total (mg g-1 FW) a 72 cv e (G) contenuto de prolina (mg g-1 FW) a 72 cv. I valur rapresentan la media ± la deviaziun standard (media ± DS) de 5 copi biologich (n = 5). Letter diferent indican diferenzi statisticament significatif intra i tratament (p < 0,05).