Present *Indiriz atual: Colonia 50931, Germania, Colonia Ricerca del cluster de eccellenza sü la rispòsta al stress celùlar en i maladì ligà al invegiament (CECAD).
La neurodejenerazion dei malatie mitocondriai l’è considerada ireversibel perqè la plastega metabolega dei neuron l’è limitada, ma l'efet de la disfonzion mitocondrial su l'autonomia cellulara del metabolism neuronal ind el corp l'è miga ben compres. Chichinscì, introdusem el proteoma specifeg cellular dei neuron de Purkinje cont una deficenza progressiva de OXPHOS causada de una dinamega de fusion mitocondrial interrota. A’l hem descovert qe la disfonzion mitocondrial l’ha scatenad un cambiament profond ind el camp de la proteomega, qe a la fin l’ha portad a l'ativar sequenzial de programa metaboleg precis inanz de la mort cellulara. Inscì, g’hem determinà l’induziun ovvia de la carbossilasi piruvada (PCx) e olter enzimi anti-invegiament che integran i intermedi del ciclo TCA. L'inibizion del PCx l'ha aggravad el stress ossidativ e la neurodejenerazion, qe l'indica qe l'aterosclerosi la g'ha un efet protetor ind i neuron senza OXPHOS. El restaur de la fusion mitocondrial ind i neuron terminalment dejenerads al invertiss completament qei carateristege metabolege qì, al prevegn insì la mort cellulara. I nostr descoverte identifegen vie precedentement descognossude qe conferissen resilienza a la disfonzion mitocondrial e mostren qe la neurodejenerazion la pœl vesser invertida anca ind i stadi tard de la malatia.
El rœl central dei mitocondri ind el mantegniment del metabolism de l'enerjia neuronal l’è sotliniad dei ampi sintom neurolojeg associads ai malatie mitocondriai umane. La plupart de qei malatie qì inn causade de mudazion jenege qe regolen l'espression jenega mitocondrial (1, 2) o la destruzion jenega ligada a la dinamega mitocondrial, qe l'influiss indiretament su la stabilitaa de l'ADN mitocondrial (mtDNA) (3, 4). El lavorar ind i modei animai l’ha demostrad qe in resposta a la disfonzion mitocondrial ind i tessuds circostant, i vie metabolege conservadore (5-7) pœden vesser ativads, qe al forniss informazion importante per una comprension profonda de la patojenesi de qei malatie complesse qì. Ind el contrast net, la nostra comprension dei cambiaments metaboleg de jener de cellule specifeg causads del faliment jeneral de la produzion de adenosina trifosfad (ATP) mitocondrial cerebral l’è fondamental (8), sotliniand la necessitaa de identifegar obietiv terapeuteg qe pœden vesser drovads per prevegnir o prevegnir i malatie. Prevenir la neurodejeneraziun (9). La mancanza de informazion l’è el fait qe i cellule nervose inn ampiament considerade per haver-g una flessibilitaa metabolega limitada rispet ai jener cellular dei tessuds circostants (10). Dat qe qei cellule qì jœgen un rœl central ind el coordinar la fornidura de metabolits ai neuron per favorir la trasmission sinaptega e responder ai condizion de lesion e de malatia, l'abilitaa de adatar el metabolism cellular ai condizion dificil del tessud cerebral l’è asquas limitada ai cellule gliai (11-14). De soraplu, l'eterojeneitaa cellular inerenta del tessud cerebral l'impediss largament el studi dei cambiaments metaboleg qe se verifegen in sotagrup neuronal specifeg. De conseguenza, se sa poc sui conseguenze esate cellular e metabolege de la disfonzion mitocondrial ind i neuron.
Per capir i conseguenze metabolege de la disfonzion mitocondrial, hem isolad i neuron de Purkinje (PN) in diferents stadi de neurodejenerazion causada de la distruzion de la fusion de la membrana esterna mitocondrial (Mfn2). Anca se i mudazion de Mfn2 ind i vesser uman inn associade a una forma de neuropatia sensorial motora ereditaria cognossuda comè tip 2A de Charcot-Marie-Tooth (15), la distruzion condizional de Mfn2 ind i rats l’è una induzion ben recognossuda de disfonzion de la fosforilazion de l'ossidazion (OXthoPHOS). I vari sotatip neuronal (16-19) e el fenotip neurodejenerativ risultant inn compagnads de sintom neurolojeg progressiv, comè i disturb del moviment (18, 19) o l'atassia cerebellar (16). Duperant una combinazion de proteomiga quantitativa senza etiqeta (LFQ), metabolomega, imajen e metods virolojeg, mostrem qe la neurodejenerazion progressiva l’indux fortament la carbossilasi del piruvad (PCx) e oltr fator coinvoljuds ind l'arteriosclerosi dei PN in vivo L'espression dei enzima. Per verificar la rilevanza de qella descoverta qì, hem specifegament sota-regolad l'espression de PCx ind i PN carents de Mfn2 e hem descovert qe qella operazion qì l'ha aggravad el stress ossidativ e l'ha acelerad la neurodejenerazion, demostrand insì qe l'azoospermia la conferiss l'adatabilitaa metabolega a la mort cellulara. L'espression grava de MFN2 la pœl salvar completament la dejenerazion terminal PN cont una deficenza grava de OXPHOS, un consum massif de ADN mitocondrial e una red mitocondrial aparentement rotta, qe l'enfatiza ulteriorment qe qella forma qì de neurodejenerazion la pœl anca recuperar-s ind el stadi cellular avanzad de la malatia.
Per visualizar i mitocondri ind i PN knockout Mfn2, hem drovad un cep de rat qe al permet ai mitocondri dipendents de Cre de mirar a l'espression Cre de la proteina fluoressenta jalla (YFP) (mtYFP) (20) e hem controllad la morfolojia mitocondrial in vivo. A’l hem descovert qe la destruzion del jen Mfn2 ind i PN la portaria a la division gradual de la red mitocondrial (Figura S1A), e el prim cambiament l’è stait trovad a 3 semane de etaa. Al contrari, la dejenerazion sostanzial del strat cellular PN, comè demostrad de la perdita de l'imunocolorazion de Calbindina, l'è miga començada infina ai 12 setemane de etaa (Figura 1, A e B). La discordanza de temp intra i prim cambiaments ind la morfolojia mitocondrial e l'inizi visibel de la mort neuronal l’ha spinjud a indagar i cambiaments metaboleg scatenads de la disfonzion mitocondrial inanz de la mort cellulara. G’hem desvilupà una strategia basà sü la classificaziun celùlar ativà de fluorescenza (FACS) per isular PN che esprim YFP (YFP+) (Figura 1C), e en ratt cuntrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), en seguit indicà cuma CT1RL (Figura). L’otimizaziun de la strategia de chiusura basada sü l’intensità relatif del segnal YFP la cunsent de purificà el corp YFP+ (YFPhigh) di PN di minga PN (YFPneg) (Figura S1B) o di putatif asson/dendritich fluoresent (YFPlow; Figura S1D cunfermà da figüra S1D cunfermà). Per verificar l'identitaa de la popolazion clasificada, hem fait la proteomica LFQ e po l'analisi dei components principal, e hem descovert qe g'è una separazion ciara intra i cellule YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). I celùl YFPhigh g’han mustrà un arichiment net de marcadur PN famus (cioè Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), ma nissun arichiment de prutein comunement espress en neuron o en olter tip de celùl (Figura 1D) ). Un cunfront intra campiun en celùl YFPhigh clasificà cattà sü en esperiment indipendent g’ha mustrà un cueficient de correlaziun> 0,9, dimustrand una bona riproducibilità intra repli biologich (Figura S1E). En suma, chesti dat g’han validà el noster pian per l’isolament acut e specifich de PN pusibel. Dejà qe el sistema de condutor L7-cre drovad l’indux la ricombinazion mosaica ind la prima semana dop el part (23), g’hem començad a s’ciopar i rats de CTRL e condizionai (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) I neuron. Despœ qe la recombinazion l'è completada, l'è ciamada Mfn2cKO a 4 setemane de etaa. Comè punt final, g’hem scernì 8 seteman de età quand el strat PN l’era intat nonostant l’ovvia frammentaziun mitocondrial (Figura 1B e Figura S1A). In del tutal, g’hem quantificà un total de 3013 prutein, di quai circa el 22% l’era basà sü anotaziun MitoCarta 2.0 basà sül proteoma mitocondrial cuma mitocondri (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L'analisi de l'espression jenega diferenzial faita a la semana 8 l'ha mostrad qe domà el 10,5% de tute i proteine ​​al g'haveva dei cambiaments significativ (Figura 1F e Figura S1F), dei quai 195 proteine ​​eren sota-regolade e 120 proteine ​​eren regolade in su (Figura 1F). Vale la pena notar qe l'"analisi de la via inovativa" de qell insema de data qì la mostra qe i jen espress in manera diferenzial partegnen principalment a un insema ristret de vie metabolege specifege (Figura 1G). Curiosamente, anca se la sota-regolazion dei vie ligade a'l OXPHOS e a la segnalazion del calci la conferma l'induzion de la disfonzion mitocondrial ind i PN scars de fusion, oltre categorie qe coinvoljen principalment el metabolism dei aminoacids inn signifegadivament regolads su, qe l'è in linea col metabolism mitocondrial qe al se verifega ind el PN mitocondrial. disfunziun.
(A) Fotografie cunfucai rapresentatif di seziun cerebellar di ratt CTRL e Mfn2cKO che mustran una perdita prugressiva de PN (calbindina, gris); i nuclei sun stà cuntracolorà cun DAPI. (B) Quantificaziun de (A) (analìs a sens unich de la varianza, ***P<0,001; n = 4 a 6 sèrcc de tri ratt). (C) Fluss de lavurà sperimental. (D) Distribuziun sü la mapa de calor di marcadur specifich de Purkinje (en volt) e olter tip de celùl (in mezz). (E) Diagrama de Venn qe al mostra el numer de proteine ​​mitocondriai identifegade ind el PN clasificad. (F) Grafich del vulcan de protein espress en mod diferenzial en i neuron Mfn2cKO a 8 seteman (valur limit de significà de 1,3). (G) L’analisi del percors de la creatività la mostra i ciinch percors püsee impurtant de regolaziun su (ross) e de regolaziun giò (blu) in del PN Mfn2cKO clasificà cuma 8 seteman. L'è mostrad el nivell medi de espression de ogni proteina rilevada. Mapa de calor en scäla di gris: valur P regulà. ns, minga impurtant.
I dats proteomeg hann mostrad qe l'espression proteiga dei compless I, III e IV l'è gradualment diminuida. I compless I, III e IV contegniven tuts sotunitaa essenziai codificads de mtDNA, inscambi el compless II, qe l’era domà codificad nuclear, l’era fondamentalment miga influenzad (Figura 2A e Figura S2A). . In coerenza coi resultads de la proteomiga, l'imunoistqimega dei sezion de tessuds cerebellar l'ha mostrad qe el nivell de sotunitaa MTCO1 (sotunitaa 1 de l'ossidasi mitocondrial del citocrom C) del compless IV in PN l'è diminuid gradualment (Figura 2B). La sotunitaa Mtatp8 codificada del mtDNA l’è staita signifegadivament redota (Figura S2A), inscambi el nivell de stat stazionari de la sotunitaa de sintasi ATP codificada nuclear l’è restad invariad, qe l’è coerent cont el cognossud compless F1 de sottaassemblaj de sintasi ATP stabel quand qe l'espression del mtDNA l’è stabel. La formaziun l’è coerent. Interrump (7). La valutaziun del nivell de mtDNA in di PN Mfn2cKO urdinà per reaziun a cadena de la polimerasi en temp real (qPCR) g’ha cunfermà la diminuziun gradual del nümer de copi de mtDNA. Rispett al grupp de cuntrol, a 8 seteman de età, sultant circa el 20% del nivell de mtDNA l’è stà mantegnuu (Figura 2C). Coerent cun chesti resultà, la coloraziun cun microscopia cunfucal di PN Mfn2cKO l’è stada duperada per rilevar el DNA, mustrand el consum dipendent del temp di nucleotid mitocondrial (Figura 2D). A’l hem descovert qe domà un quai candidad coinvolt ind la degradazion dei proteine ​​mitocondrial e ind la resposta al stress eren regolads in su, compres Lonp1, Afg3l2 e Clpx e fator de assemblaj compless OXPHOS. Nugun cambiament significativ ind i nivei de proteine ​​coinvoljude ind l'apoptosi l'è stait rilevad (Figura S2B). In manera simil, hem descovert qe i mitocondri e i canai del reticol endoplasmeg coinvoljuds ind el trasport del calci i g’hann domà cambiaments minor (Figura S2C). De soraplu, la valutazion dei proteine ​​ligade a l'autofajia l'ha miga trovad cambiaments significativ, qe l'è coerent cont l'induzion visibel dei autofagosoma osservada in vivo per imunoistqimega e microscopia eletronega (Figura S3). Comesessia, la disfonzion progressiva de l'OXPHOS ind i PN l'è compagnada de evidents cambiaments mitocondriai ultrastruturai. I grup mitocondriai pœden vesser osservads ind i corp cellular e ind i arbor dendriteg dei PN Mfn2cKO de etaa de 5 e 8 setemane, e la strutura de la membrana interna l’ha subid dei cambiaments profonds (Figura S4, A e B). Coerent cun chesti cambiament ultrastrütürai e una diminuziun significativa del ADNmt, l’analìs di fett cerebral agud cun ester de metil de tetrametilrodamina (TMRM) g’ha mustrà che el putenzial de la membrana mitocondrial in di PN Mfn2cKO l’è stà significativament diminuì (Figura S4C).
(A) Analisi del curs del temp del livel de espresiun del cumpless OXPHOS. Cunsiderar sultant i protein cun P<0,05 a 8 seteman (ANOVA a dü vie). Linea puntegiada: nissuna regulaziun rispett a CTRL. (B) A sinistra: un esempi de sezion cerebellar etiqetada cont anticorp anti-MTCO1 (barra de scala, 20 μm). L’area ocupada dei corp cellular de Purkinje l’è recuverta de jall. A destra: Quantificaziun di nivell de MTCO1 (analìs a sens unich de varianza; n = 7 a 20 celùl analizà de tri ratt). (C) Analis qPCR del nümer de copi mtDNA in del PN urdinà (analis a sens unich de varianza; n = 3 a 7 ratt). (D) A sinistra: un esempi de fetta cerebellar etiqetada cont un anticorp anti-ADN (barra de scala, 20 μm). L’area ocupada dei corp cellular de Purkinje l’è recuverta de jall. A destra: Quantificaziun di leziun mtDNA (analìs a sens unich de varianza; n = 5 a 9 celùl de tri ratt). (E) Un esempi de una sezion cerebellar aguda qe la mostra i cellule mitoYFP + Purkinje (freça) ind una registrazion de morsa de tocc a cellula intrega. (F) Quantificaziun de la cürva IV. (G) Registraziun rapresentatif del inieziun de curent depolarizant en i celùl de Purkinje CTRL e Mfn2cKO. Traccia superiur: el prim impuls che g’ha scatenà AP. Traccia in bas: Frequenza massima AP. (H) Quantificaziun di input spuntane postsinaptich (sPSP). La tracia de registraziun rapresentatif e el sò raport de zoom sun mustrà en (I). L’analis unidireziunal de la varianza g’ha analizà n = 5 a 20 celùl de tri ratt. I dati sun espress cuma media±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Tracc rapresentatif de AP spuntane registrà duperand la modalità de morsa de tocc perfurà. Traccia superiur: Frequenza massima AP. Traccia in bas: zoom de un singul AP. (K) Quantificar la frequenza media e massima AP segond (J). Pruva de Mann-Whitney; n = 5 celùl sun stà analizà de quater ratt. I dati sun espress cuma media±SEM; minga impurtant.
Un dann ovvi de OXPHOS l’è stait rilevad ind el PN Mfn2cKO de 8 semane, qe l’indica qe la fonzion fisiolojega dei neuron l’è severament anormal. Donca, g’hem analizad i carateristege eletrege passive dei neuron deficients de OXPHOS a 4 a 5 setemane e a 7 a 8 setemane cont l’esecuzion de registrazion de morsa de tocc intercellulare in fete cerebellar acute (Figura 2E). Inscì, el putenzial medi de la membrana de ripòs e la resistenza a l’entrada di neuron Mfn2cKO l’eran simil al cuntrol, anca se g’heren di diferenzi sutil intra i celùl (Tabela 1). Inscì, a 4 a 5 seteman de età, sun stà truvà no cambiament significatif in de la relaziun curent-tensiun (cürva IV) (Figura 2F). Comesessia, nissun neuron Mfn2cKO de 7 a 8 setemane l’è soravissuu al regim IV (pas de iperpolarizazion), qe l’indica qe g’è una ciara sensibilitaa a’l potenzial de iperpolarizazion in qella fase tarda qì. Al contrari, ind i neuron Mfn2cKO, i corrents depolarizant qe causen i scariqe de potenzial de azion ripetitiva (AP) inn ben tollerade, qe l’indica qe i so modei de scariga complessiv inn miga significativament diferents de quei dei neuron de controll de 8 setemane (Tabela 1 e Figura 2G). Inscì, la frequenza e l’ampieza di curent postsinaptich spuntane (sPSC) l’eran paragunabil a chel del grupp de cuntrol e la frequenza di event l’è aumentada de 4 seteman a 5 seteman a 7 seteman a 8 seteman cunt un aument simil (Figura 2, H e I). El periud de maturaziun sinaptich en i PN (25). Resultà simil sun stà ottegnuu dopu di tocc de PN perfurà. Qella configurazion qì la prevegn la possibel compensazion dei difets ATP cellular, comè qe al podaria suceder ind la registrazion de la morsa de toqe cellular intere. In particolar, el potenzial de la membrana de ripos e la frequenza de sparar spontanea dei neuron Mfn2cKO inn staits miga influenzads (Figura 2, J e K). En suma, chesti resultà indican che i PN cunt un’ovvia disfunziun OXPHOS pœden afruntar ben i mudei de scarica a volta frequenza, indicand che g’he un mecanism de cumpens che ge cunsent de mantegnir di rispost eletrofisiologegh quasi nurmai.
I dat sun espress cuma media ± SEM (analìs a sens unich de la varianza, test de cunfront multiplo de Holm-Sidak; *P<0,05). El numer del unità l’è indicà di parentesi.
G’hem pensà de indagar se qual-sa-vöör categuria in del insema de dati proteomich (Figura 1G) includ percors che pœden cuntrastar una deficenza grave de OXPHOS, spiegand inscì perché el PN afetà pœu mantegnir un’eletrofisiologia quasi nurmal (Figura 2, E a K). . L'analisi proteomega l'ha mostrad qe i enzima coinvoljuds ind el catabolism dei aminoacids a cadena ramificada (BCAA) eren signifegadivament regolads in su (Figura 3A e Figura S5A), e el prodot final acetil-CoA (CoA) o succinil CoA al pœl integrar i tricarbossilats ind l'arteriosclerosi TCA). G’hem descovert qe el contenut de la trasaminasi BCAA 1 (BCAT1) e de la BCAT2 l’è aumentad tuts duu. Catalizen el prim pass del catabolism BCAA col jenerar glutamad de α-cetoglutarad (26). Tute i sotunitaa qe componen el compless de l’acid cheto-desidrojenasi a cadena ramificada (BCKD) inn regolads su (el compless al cataliza la decarbossilazion sucessiva e ireversibel del sqeletr de carboni BCAA risultant) (Figura 3A e Figura S5A). Però, nissun cambiament evident in del BCAA stess l’è stà truvà in del PN urdinà, che pœu vèss dovüu al aument del assorbiment celùlar de chesti aminoacid essenziai o al üs de olter funt (glucosio o acid laitich) per integrar el ciclo TCA (Figura S5B). I PN senza OXPHOS hann anca mostrad un'aument de la decomposizion de la glutamina e de l'ativitaa de trasaminazion a 8 setemane de etaa, qe la pœl vesser riflessada de l'alta-regolazion dei enzima mitocondrial glutaminasi (GLS) e transaminasi piruvad de glutamina 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Vale la pena notar qe l'alta-regolazion del GLS l'è limitada a l'isoforma de glutaminasi C spliçada (GLS-GAC) (el cambiament de Mfn2cKO/CTRL l'è incirca 4,5 vœlte, P = 0,05), e la soa regolazion alta specifega ind i tessuds tumorai Pœl sostegner el mitonergiondrial. (27).
(A) La mapa de calor la mostra el cambiament de piega ind el nivell proteig per la via specifegada a 8 setemane. (B) Esempi de una fetta cerebellar marcada cun anticorp anti-PCx (barra de scäla, 20 μm). La freça jalla la ponta al corp cellular de Purkinje. (C) Analis de espresiun proteich in del curs del temp identificada cuma candidà impurtant per l’aterosclerosi (pruva t multipla, *FDR <5%; n = 3-5 ratt). (D) Sora: Un diagramm schemateg qe al mostra i diverse manere de entrar ind el carboni etiqetad contegnud ind el traçador de piruvad [1-13C] (çoè a travers PDH o via transarterial). In bas: el grafich del violin mustra la percentual de carbonio marcad singul (M1) cunvertì en acid aspartich, acid citric e acid malich dopu l’etichettaziun di fett cerebellar acut cun [1-13C] piruvat (pruva t accuppià; ** P <0,01). (E) Analis cumpleta de la stòria del temp del percors indicà. Considera sultant i protein cun P<0,05 a 8 seteman. Linea trategiada: nissun valur de regolaziun (analìs a dü vie de varianza; * P <0,05; *** P <0,001). I dat sun espress cuma media±SEM.
Ind la nostra analisi, el catabolism BCAA l’è deventad vuna dei vie ciav de regolazion su. Chestu fatt sugerisc fortment che el volum de ventilaziun che entra in del ciclo TCA pœu vèss cambià en PN senza OXPHOS. Quest al pœl representar una forma importanta de ricablagg metaboleg neuronal, qe al pœl haver-g un impat diret su la fisiolojia neuronal e su la soravivenza durant el mantegniment de una disfonzion OXPHOS grave. Coerent cun chesta ipotès, g’hem descuvert che el principal enzima antiaterosclerotich PCx l’è regulà en volt (Mfn2cKO/CTRL cambia circa 1,5 volt; figüra 3A), che cataliza la cunversiun del piruvad en ossaloacetà (28), che se cret che l’è in del bravell 30). En cunformità cunt i resultà de la proteomich, la microscopia cunfucal g’ha mustrà che l’espresiun de PCx l’è stada specificament e significativament aumentada en i PN senza OXPHOS, menter la reatività de PCx l’è stada principalment limitada ai celùl gliai de Bergmann visin del cuntrol (Figura 3B). Per testar funzionalment l’opregolazion osservada de PCx, g’hem tratad i fete cerebellar agude cont el traçador de piruvat [1-13C]. Quand qe el piruvad l’è stait ossidad de la piruvada deidrojenasi (PDH), la soa etiqeta isotop l’è sparida, ma l’è incorporad ind i intermedi del circol TCA quand qe el piruvad l’è metabolizad de reazion vascular (Figura 3D). A sostegn di noster dati proteomich, g’hem osservad un grand nümer de marcadur de chestu traçant in del acid aspartich di fett Mfn2cKO, menter anca l’acid citric e l’acid malich g’havevan una tendenza moderada, anca se minga significatif (Figura 3D).
Ind i neuron dopamin dei rats MitoPark cont disfonzion mitocondrial causada dei neuron dopamin qe destrugen specifegament el jen del fator de trascrizion mitocondrial A (Tfam) (Figura S6B), l'espression PCx l'è staita anca significativament regolada in su (31), qe l'indica qe la disfonzion de l'arteriosclerosi de l'acid aceton l'è la disfunzion de l'arteriosclerosi. OSFO in del corp. Vale la pena notar qe l’è stait descovert qe i enzima uneg (32-34) qe pœden vesser espress ind i neuron qe pœden vesser associads a l'arteriosclerosi inn signifegadivament sora-regolads ind i PN senza OXPHOS, comè la carbossilasi propionil-CoA (PCC-A), el malonil-CoA el mitochil-CoA al convert. enzima 3 (ME3), el so rœl principal l’è recuperar el piruvad del malad (Figura 3, A e C) (33, 35). Ancamò, g’hem truvà un aument significatif del enzima Pdk3, che fosforila e donca inativa el PDH (36), menter nissun cambiament l’è stà rilevà in del enzima Pdp1 che ativa el PDH o el cumpless enzimatich PDH stess (Figura 3A). Coerentment, ind i PN Mern2cKO, la fosforilazion de la sotunitaa α1 de la sotunitaa α1 (PDHE1α) del component de la piruvata deidrogenasi E1 del compless PDH in Ser293 (cognossud per inibir l'ativitaa enzimega del PDH) l'è staita meiorada (Figura S6C) (Figura S6C). El piruvad al g’ha nissun acess vascolar.
Finalment, hem descovert qe la super via de la biosintesi de la serina e de la glicina, el circol collegad del folat mitocondrial (1C) e la biosintesi de la prolina (Figura 1G e Figura S5C) inn tuts signifegadivament regolads in su, segond i raports, durant el process de ativar. I tessuds circostante inn ativads cont la disfonzion mitocondrial (5-7). L'analisi confocal qe la sostegn qei dats proteomeg qì l'ha mostrad qe ind el PN cont mancanza de OXPHOS, i fete cerebellar de rats de 8 semane inn staite sometude a la serina idrossimetiltransferasi 2 (SHMT2), un enzima ciav del circol folad mitocondrial. Risposta imunitaria significativa (Figura S5D). In 13 fete cerebellar agude incubade cond CU-glucosi, i esperiments de traçament metaboleg hann confermad ulteriorment l'alza-regolazion de la biosintesi de la serina e de la prolina, indicand qe el fluss de isoforme de carboni in serina e prolina l'è aumentad (Figura S5E). Del moment qe i reazion promosse de GLS e GPT2 inn responsabel de la sintesi del glutamad de la glutamina e de la trasaminazion intra el glutamad e l'α-cetoglutarad, la soa regolazion in su l'indica qe i neuron carents de OXPHOS g'hann una domanda aumentada de glutamad, Quest al pœl vesser mirad a mantegnir l'aumentada biosintesi de prourelina C). Al contrari de qei cambiaments qì, un'analisi proteomega dei astrocita cerebellar dei rats Mfn2cKO specifeg del PN l'ha mostrad qe qei vie qì (comprese tute i antiperossidasi) i cambiaven miga in manera signifegativa ind l'espression, demostrand insì qe Qella redirezion metabolega qì l'è seletiva a'l PN degradad (Fig. S6, G).
In sintesi, qei analisi qì hann rivelad modei significativament diferents de attivazion temporal de vie metabolege specifege ind i PN. Anca se la fonzion mitocondrial neuronal anormal la pœl portar a l'aterosclerosi precoç e a la rimodellazion 1C (Figura 3E e Figura S5C), e anca a cambiaments prevedibei ind l'espression dei compless I e IV, i cambiaments ind la sintesi de serina de novo inn domà. Disfunziun OXPHOS (Figura 3E e Figura S5C). Qei resultads qì definissen un process sequenzial ind el qual la resposta mitocondrial indota del stress (ciclo 1C) e la citoplasmega (biosintesi de la serina) i responden in manera sinerjetega cont l'aument de l'aterosclerosi ind el circol TCA per rimodelar el metabolism neuronal.
I PN deficents de OXPHOS de 8 setemane pœden mantegnir un'ativitaa de ecitazion a volta frequenza e subir una reconnession metabolega significativa per compensar la disfonzion mitocondrial. Qella descoverta qì la solleva una possibilitaa interessanta qe anca in qell moment qì, qei cellule qì pœden anca ricever un intervent terapeuteg per ritardar o prevegnir la neurodejenerazion. Tard. G’hem risolt chesta pusibilità travers dü intervent indipendent. Ind el prim metod, hem projetad un vetor del virus adeno-associad (AAV) dipendent de Cre insì qe el MFN2 al pœl vesser espress seletivament in PN in vivo carents de OXPHOS (Figura S7A). L’AAV qe codifega MFN2 e el jen segnalador fluoresent mCherry (Mfn2-AAV) inn staits verifegads ind i colture de neuron primari in vitro, qe l’ha fait esprimer el MFN2 ind una manera dipendenta de Cre e l’ha salvad la morfolojia mitocondrial, prevenend insì la neuromutazion ind i neuron Mfn2, B Figura S7). Sucesivament, g’hem fatt di esperiment in vivo per cunsegnar stereotaticament Mfn2-AAV de 8 seteman a la cortex cerebellar de Mfn2cKO e di ratt cuntrol, e g’hem analizà i ratt de 12 seteman (Figura 4A). I rats Mfn2cKO tratads inn morts (Figura 1, A e B) (16). La traduzion viral in vivo l’è risultada ind l'espression seletiva de PN ind un quai circol cerebellar (Figura S7, G e H). L'iniezion de l'AAV de controll qe l'esprim domà la mCherry (Ctrl-AAV) l'ha miga avud un efet significativ sul grad de neurodejenerazion ind i animai Mfn2cKO. Al cuntrari, l’analìs di Mfn2cKO trasdù cun Mfn2-AAV g’ha mustrà un effet prutetif significatif del strat celùlar PN (Figura 4, B e C). In particolar, la densitaa dei neuron la par vesser asquas indistinguibil dei animai de controll (Figura 4, B e C, e Figura S7, H e I). L'espression de MFN1 ma miga de MFN2 l'è eficax al stess mod ind el salvar la mort neuronal (Figura 4C e Figura S7, C e F), qe l'indica qe l'espression de MFN1 etopeg la pœl integrar efetivament la mancanza de MFN2. Ulterior analisi a nivell PN singol l’ha mostrad qe el Mfn2-AAV l’ha salvad in gran part l’ultrastrutura dei mitocondri, l’ha normalizad i nivei de mtDNA e l’ha invertid l’olta espresion del marcador anti-angiojenesi PCx (Figura 4, C a E). L’ispezion visiva dei rats Mfn2cKO salvads ind un stait de ripos l’ha mostrad qe la soa postura e i sintom motore (moviment S1 a S3) inn meiorads. In conclusiun, chesti esperiment mostran che la reintroduziun ritardada de MFN2 en PN gravement scars en OXPHOS l’è sufisent per invertir el consum de mtDNA e induir l’aterosclerosi, prevegnind inscì la dejeneraziun di asson e la mort neuronal in vivo.
(A) Un sqema qe al mostra el program sperimental per inietar AAV qe codifica MFN2 quand qe la via metabolega indicada l’è ativada. (B) Imagen cunfucai rapresentatif de fett cerebellar de 12 seteman trasdù a 8 seteman en ratt Mfn2cKO e etichettà cun anticorp anti-calbindina. A destra: ridimensionament dei fibre dei assoni. La scala del zoom dei asson l’è de 450 e 75 μm. (C) A sinistra: Quantificaziun de la densità celùlar de Purkinje in del ciclo de traduziun AAV (AAV+) (analìs a sens unich de la varianza; n = 3 ratt). A destra: analìs de fœuch mtDNA en PN trasdott a la setimana 12 (test-t minga accuppià; n = 6 celùl de tri ratt). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografi eletronich de trasmissiun rapresentatif di PN di seziun cerebellar Mfn2cKO trasdù cunt i vetur virai indicà. La maschera ròsa mustra l’area ocupada di dendrit e el quadrà giall puntegià mustra el zoom previst a destra; n rapresenta el nucleo. Barra de scäla, 1μm. (E) mostra un esempi de coloraziun PCx en PN trasdott a 12 seteman. Barra de scäla, 20μm. OE, soraespression; FC, cambiament de piega.
Finalment, hem indagad l'importanza de la soravivenza cellulara indota de la perossidasi ind i PN qe hann sperimentad una disfonzion OXPHOS. A’l hem jenerad mCherry qe codifega l'ARN-sh AAV (ARN a forca curta) qe al mira specifegament a l'ARNm PCx del rat (AAV-shPCx), e a’m siringad el virus o el so controll mes’ciad (AAV-scr) ind el cervell dei rats Mfn2cKO. L’inieziun l’è stada fada in de la quarta setimana d’età (Figura 5A) per ottener un knockdown eficaz de PCx durant el periud induè l’espresiun de PCx l’è aumentada (Figura 3C) e el strat celùlar PN l’era ancamò intatt (Figura 1A). Vale la pena notar qe el sbat giò PCx (Figura S8A) al porta a un’acelerazion significativa de la mort PN, qe l’è limitada a l’anel infetad (Figura 5, B e C). Per cumprender el mecanism di efet metabolich induu de la regolaziun su de PCx, g’hem stüdià el stat de ossid-reduziun di PN dopu el knockdown de PCx e el biosensur ottich mediat de AAV Grx1-roGFP2 sun stà espress cuntempuraneament (Figura S8, B a D) per valutar el glutation potenzial del peptid3 El relatif3). Pœu, g’hem fatt una microscopia de imaging a fluorescenza a dü foton (FLIM) en fett cerebrai acut de Mfn2cKO de 7 seteman o de cumpagn de cucciul de cuntrol per rilevar putenziai cambiament in del stat de ossid-reduziun citoplasmatich dopu la verificaziun di cundiziun FLIM (Figura S8, E a G). L'analisi l'ha mostrad un aument significativ ind el stat de ossidazion de un singol PN Mfn2cKO senza espresion PCx, qe l'è diferent dei neuron de controll o dei PN Mfn2cKO qe esprimen domà shRNA mes'ciad (Figura 5, D e E). Quand qe l'espression de PCx l'è staita sota-regolada, la percentual de PN Mfn2cKO qe mostrava un stat altamente ossidad l'è aumentada de plussee de tre vœlte (Figura 5E), qe l'indica qe l'alta-regolazion de PCx l'ha mantegnud la capacitaa de ossid-reduzion dei neuron dejenerads.
(A) Un sqema qe al mostra el program sperimental per inietar AAV qe codifica shPCx quand qe la via metabolega indicada l’è ativada. (B) Fotografie cunfocai rapresentatif de seziun cerebellar de 8 seteman en ratt Mfn2cKO trasdù e etichettà cun anticorp anticalcineurina a 4 seteman. Barra de scäla, 450μm. (C) Quantificaziun de la densità celùlar de Purkinje en circoli trasdù AAV (analìs a sens unich de varianza; n = 3 a 4 ratt). I dati sun espress cuma media±SEM; ***P<0,001. (D) L’imagin FLIM rapresentativa mustra la durada media de vida de PN de 7 seteman che esprim el sensur de ossid-reduziun del glutation Grx1-roGFP2 en i cundiziun sperimentai specificà. Raport LUT (tabella de ricerca): interval de temp de soravivenza (en picosegond). Barra de scäla, 25μm. (E) L’istogramm al mostra la distribuzion dei valor de vita Grx1-roGFP2 de (D) (n=158 a 368 cellule in duu rats in ogni condizion). El grafich a tor sora ogni istogramm: mustra el nümer de celùl cun valur de durada significativament püsee luungh (ross, ossidà) o püsee cuurt (blu, ridott), che süperan 1 SD del valur medi de durada en CTRL-AAV-scr. (F) El modell propost al mostra l’efet protetor de l’opregolazion del PCx neuronal.
In tuts, i dats qe fornim qì mostren qe la reespression de MFN2 la pœl salvar completament el PN avanzad cont una deficenza grave de OXPHOS, un esauriment grav del mtDNA e una morfolojia estremament anormal simil a l'ista, fornend insì un progress continu anca ind i malatie avanzade. La neurodejenerazion la forniss prœve reversibel del stadi inanz de la mort cellulara. Qell grad qì de flessibilitaa metabolega l’è sotliniad ulteriorment de l'abilitaa dei neuron de indur l'aterosclerosi (un ricablagg del circol TCA), qe l'inibix l'espression PCx ind i PN senza OXPHOS e l'aumenta la mort cellulara, jogand insì un rœl protetor (Figura 5F).
In qell studi qì, hem fornid la prœva qe la resposta dei PN a la disfonzion OXPHOS l’è de converger gradualment a l'aterosclerosi del circol TCA a travers la via de attivazion diferenzial ativada dei programa metaboleg. A’l hem confermad l'analisi proteomega cont tants metods complementar e hem rivelad qe quand qe inn sfidads de una disfonzion mitocondrial grave, i neuron g’hann una forma de elastecitaa metabolega precedentement miga cognossuda. Per la nostra sorpresa, l'intregh process de ricablagg al marca miga necessariament el stat metaboleg terminal qe al compagna la neurodejenerazion gradualment e in manera ireversibel, ma i noster dats sujerissen qe al pœl costituir un neuron de manteniment anca ind el stadi inanz de la mort cellulara Mecanism de compensazion fonzional. Qell resultad qì l’indica qe i neuron g’hann un grad considerevol de plastega metabolega ind el corp. Qell fait qì al prœva qe la reintroduzion sucessiva de MFN2 la pœl invertir l'espression dei marcador metaboleg ciav e prevegnir la dejenerazion del PN. Al contrari, l’inibiss l’aterosclerosi e l’acelera i gnerv. trasessual.
Vun dei resultads plussee interessants ind la nostra recerca l’è qe i PN senza OXPHOS pœden modifegar el metabolism del circol TCA cont la regolazion in su dei enzima qe stimolen specifegament l'arteriosclerosi. El riorganizament metaboleg l’è una carateristega comuna dei cellule tumorai, una quaidun dei quai la fa afidament su la glutamina per integrar i intermedi del circol TCA per produr equivalent redutor, qe guiden la cadena respiratoria e mantegnen la produzion de precursor de la biosintesi lipidega e nucleotidega (39, 40). Un stüdi recent g’ha mustrà che en i tessü periferich che sperimentan una disfunziun OXPHOS, la riconessiun del metabolism glutamina/glutamad l’è anca una carateristich impurtant (5, 41), induè la direziun del entrà de la glutamina in del ciclo TCA dipend de A causa de la gravità de la leziun OXPHOS (41). ). A bon cunt, g’è una mancanza de prœve ciare su qualsessia someianza de la plastega metabolega neuronal ind el corp e la soa possibel relevanza ind el contest de la malatia. Ind un recent studi in vitro, i neuron cortegai primari hann demostrad de mobilitar piscine de glutamad per la neurotrasmission, col promover insì el metabolism ossidativ e l'aterosclerosi in condizion de stress metaboleg (42). Vale la pena notar qe sota l'inibizion farmacolojega de l'enzima del ciclo TCA succinata deidrogenasi, se cred qe la carbossilazion del piruvad la mantegn la sintesi de ossaloacetad ind i neuron de granul cerebellar coltivads (34). Però, la rilevanza fisiolojega de qei mecanism qì per el tessud cerebral (indov qe se cred qe l’aterosclerosi la sia principalment confinada ai astrocita) la g’ha ancamò un significad fisiolojeg important (43). In qell cas qì, i noster dats mostren qe i PN dannezads de OXPHOS ind el corp pœden vesser passads a la degradazzion del BCAA e a la carbossilazion del piruvad, qe inn i duu font principai de suplementazion dei intermedi de la piscina TCA. Anca se l’è stait propost el contribud putativ del catabolism BCAA al metabolism de l’enerjia neuronal, olter al rœl del glutamad e del GABA per la neurotrasmission (44), g’è ancamò no dei prœve de qei mecanism qì in vivo. Donca, l’è facil specular qe i PN disfonzionai pœden compensar automategament el consum de intermedi TCA guidads del process de assimilazion aumentand l'aterosclerosi. In particolar, l'opregolazion del PCx la pœl vesser necessaria per mantegnir una domanda aumentada de acid aspartig, qe l'è sujerida ind i cellule proliferante cont disfonzion mitocondrial (45). Comesessia, la nostra analisi metabolomega l’ha miga rivelad cambiaments significativ ind el nivell a stat stazionari de l’acid aspartig ind i PN Mfn2cKO (Figura S6A), qe presumibilment al riflet l’utilizazion metabolega diferenta de l’acid aspartig intra i cellule proliferante e i neuron post-mitoteg. Anca se el mecanism esat de l’opregolazion del PCx ind i neuron disfonzionai in vivo al resta de vesser caraterizad, hem demostrad qe qella resposta prematura qì la gioga un rœl important ind el mantegniment del stat de ossid-reduzion dei neuron, qe l’è stait demostrad ind i esperiments FLIM sui fete cerebellar. In particolar, la prevenzion dei PN de regolar su la PCx la pœl portar a un stat plussee ossidad e acelerar la mort cellulara. L'ativar de la degradazion del BCAA e la carbossilazion del piruvad inn miga manere de caraterizar i tessuds perifereg de la disfonzion mitocondrial (7). Donca, i someien vesser una carateristega prioritaria dei neuron carents de OXPHOS, anca se miga l'unega carateristega, qe l'è importanta per la neurodejenerazion. .
La malatia cerebellar l’è un tip eterojen de malatia neurodejenerativa qe de solit la se manifesta comè atassia e despess la danneza i PN (46). Qella popolazion de neuron qì l’è particolarment vunerabel a la disfonzion mitocondrial perqè la soa dejenerazion seletiva ind i rats l’è suficent per reprodur tants dei sintom motor qe caraterizen l'atassia spinocerebellar umana (16, 47, 48). Segond i raports, un modell de rat transjeneg cont un jen mudant l'è associad cont l'atassia spinocerebellar umana e al g'ha una disfonzion mitocondrial (49, 50), sotliniand l'importanza de studiar i conseguenze de la deficenza de OXPHOS ind el PNPH. Donca, l’è particolarment adeguad per isolar e studiar eficaxement qella popolazion unega de neuron qì. Comesessia, vist qe i PN inn sensibei fiss a la pression e representen una bassa proporzion de l'intera popolazion de cellule cerebellar, per tants studi basads su l'omica, la separazion seletiva de lor comè cellule intrege l'è ancamò un aspet dificil. Anca se l’è asquas impossibel otegnir una mancanza assoluta de contaminazion de oltr jener de cellule (in particolar dei tessuds adults), hem combinad un pass de dissociazion eficax cont el FACS per otegnir un numer suficent de neuron vitai per l'analisi proteomega a vall, e g’hann una copertura proteiga plutost volta (incirca el set de proteine) confrontad cont el cerxibel de proteine. (51). Preservand la vitalitaa dei cellule intrege, el metod qe fornim qì al ne permet miga domà de controllar i cambiaments ind i vie metabolege ind i mitocondri, ma anca de controllar i cambiaments ind i so controparts citoplasmatege, qe al complementa l'utilizazion dei tags de membrana mitocondrial per arricchir el tip cellular del tessud micondrial El nœv metod (52, 53). El metod qe descrivom l’è miga domà ligad a’l studi dei cellule de Purkinje, ma al pœl vesser facilment aplicad a qualsessia jener de cellula per far front ai cambiaments metaboleg ind i cervell malads, compres oltr modei de disfonzion mitocondrial.
Per finir, hem identifegad una finestra terapeutega durant qell process qì de riorganizazion metaboleg qe al pœl invertir completament i segn ciav del stress cellular e prevegnir la dejenerazion neuronal. Donca, la comprension dei implicazion fonzionai del recablagg descrivud qì la pœl fornir informazion fondamentai sui possibei trataments per mantegnir la faitibilitaa neuronal durant la disfonzion mitocondrial. La recerca futura mirada a dessezionar i cambiaments ind el metabolism de l’enerjia in oltr jener de cellule cerebrai l’è necessaria per rivelar completament l’applicabilitaa de qell principi qì a oltre malatie neurolojege.
I rats MitoPark inn staits descrivuds in precedenza (31). I rats C57BL/6N cont i jen Mfn2 qe la fianca loxP inn staits descrivuds in precedenza (18) e incroxiads cont i rats L7-Cre (23). La projenia dobia eterozigota risultante l’è staita pœ incroxada cont rats omozigots Mfn2loxP/Mfn2loxP per jenerar dei knockout jeneg specifeg de Purkinje per Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ind un sotainsema de acopiament, l'allel SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) l'è stait introdot a travers dei incroxi adizionai (20). Tüt i procedür animal sun stà fatt segond i linee guida europee, naziunai e istituziunai e apruvà de LandesamtfürNatur de Umwelt e de Verbraucherschutz, Renania del Nord-Westfalia, Germania. El lavurà süi animai segue anca i orientament de la Federaziun Europea di Asociaziun de Scienzi Animai de Laboratori.
Dopu l’anestetizaziun de la dislocaziun cervical de la dònna incinta, l’embriun del rat l’è isulà (E13). La cortex l’è staita dessezionada ind una soluzion de sal bilançada de Hanks (HBSS) integrada cond 10 mM de Hepes e passada sul mez de l’aquila modifegada de Dulbecco qe al contegniva papaina (20 U/ml) e cisteina (1μg/ml). Incubà el tessü en DMEM) e dissocial per digestion enzimatich. Ml) a 37°C per 20 minut, e dopu fresà mecanicament en DMEM integrà cunt el 10% de sèrum bovin fetal. I celùl sun stà sementà sü latt de veder rivestii de polilisina a una densità de 2 × 106 per plat de cültüra de 6 cm o a una densità de 0,5 × 105 celùl/cm2 per l’analìs de imaging. Dopu 4 our, el mez l’è stà sostituì cunt un mez senza sèrum Neurobasal che g’haveva denter l’1% de suplement B27 e 0,5 mM de GlutaMax. I neuron sun stà pœu mantegnuu a 37°C e al 5% de CO2 durant tüt l’esperiment e alimentà una volta la setimana. Per indur la ricombinaziun in vitro, 3 μl (plato de cültüra cun 24 pozz) o 0,5 μl (placa de cültüra cun 24 pozz) del seguent vetur del virus AAV9 sun stà duperà per traitar i neuron el segond dì in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addjen, numer de catalog 105530-AAV9) e AAV9.
L'ADN complementar del rat Mfn1 e Mfn2 (otegnud rispetivament del plasmid Addgene #23212 e #23213) l'è marcad cont la sequenza V5 (GKPIPNPLLGLDST) a'l termin C e l'è fondud cont mCherry ind el quader a travers la sequenza T2A. Grx1-roGFP2 l’è un regal del TP Dick DFKZ de Heidelberg. Sostituend la cassetta tdTomato duperand metud de clùnaziun cunvenziunal, la cassetta l’è stada sottaclùnada in de la spina dorsal pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numer de riferiment addgen 28306) per generar pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV2-V5, Vetur FLEX-mCelizza-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Una strategia simil l’è stada duperada per generà el vetur di cuntrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Per jenerar el costrut AAV-shPCx, l’è necessari un vetor plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), qe al contegn la sequenza de ADN qe la codifega el shRNA mirad al PCx del rat (5 3′) Sota el controll del promodor U6, mCherry l’è drovad sota el controll del promodor CMV. La produzion de vetor AAV ausiliari l’è staita faita segond i istruzion del produtor (Cell Biolabs). In curt, dupera un plasmid de trasferiment che porta mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) trasfeziun transitoria de celùla mFAV2-29 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), tant’mè la proteina capsida AAV1 e la proteina acessoria del plasmid de imballaj, cont el metod del fosfad de calci. El soranatant del virus grezz l’è stait otegnud cont circoi de congelament-sciogliment ind un bagn de giaç sec/etanol e dei cellule lisade ind una soluzion salina tamponada cond fosfad (PBS). El vetur AAV l’è stà purificà cun ultracentrifugaziun discontinua a gradient de jodixanol (24 our a 32.000 rpm e 4°C) e cuncentrà duperand un filter centrifuga Amicon ultra-15. El titer del genoma de AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 copia del genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX l’è stà misurà cuma prima (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
I neuron primari inn staits raspads fœra in PBS 1x fregg comè el giaç, pelletads e pœ omojenizads in tampon de lisi al 0,5% Triton X-100 / 0,5% desossicolad de sodi/PBS qe al contegn fosfatasi e inibidor de la proteasi (Roche). La quantificaziun di prutein l’è stada fada duperand el test del acid bicinconinich (Thermo Fisher Scientific). I protein sun stà pœu separà per eletroforesi sü jel de poliacrilamida SDS e dopu macchià sü una membrana de fluorur de poliviniliden (GE Healthcare). Blocca i sit minga specifich e incuba cun l’anticorp primari (varda Tabela S1 per i detai) in del 5% de latt en TBST (salina tamponada Tris cun Tween), i pass de lavagg e l’anticorp segondari in TBST Incuba. Incubar cun anticorp primari durant la nott a +4°C. Dopu el lavagg, aplicà l’anticorp segondari per 2 o a temperadüra ambient. Dopu, incuband l’istess blot cunt un anticorp anti-β-actina, l’è stà cunfermà l’istess carich. Rilevament cun la cunversiun en chimiluminescenza e aumentand la chimiluminescenza (GE Healthcare).
I neuron precedentement sementà sü latt de veder sun stà fissà cunt el 4% de paraformaldeid (PFA)/PBS al punt de temp specificà a temperadüra ambient per 10 minut. I copertur sun prima permeà cun 0,1% de Triton X-100/PBS per 5 minut a temperadüra ambient, e dopu en tampon de blocch [3% de albumina sérica bovina (BSA)/PBS]. El segond dì, i copertur sun stà lavà cun tampon de blocch e incubà cun l’anticorp segondari coniugà a fluorofor aproprià per 2 our a temperadüra ambient; infin, i campiun sun stà lavà ben en PBS cun 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) l’è cuntratint e dopu fissà sü la vetrina del miscoscopio cun Aqua-Poly/Mount.
I ratt (maschi e femina) sun stà anestetizà per inieziun intraperitoneal de ketamina (130 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e somministrà sottacutaneament cun analgesich carprofen (5 mg/kg), e mettuu en un strüment stereotàtich (Kopf) cun equipaggiament de guerra. Espon el cran e dupera un trapano dental per diluir la part de la corteza cerebellar curispundent al oss mis (de lambda: coa 1,8, lateral 1, curispundent ai lobul IV e V). Düpera un aguja de siringa cürva per crear cun atenziun un büs piscinin in del cran per evitar de desfà la vascolatüra sotta. Quind el capillar de veder sottil tirà l’è lentament inserid in del microbüs (de -1,3 a -1 sul lat ventral de la materia dura), e de 200 a 300 nl de AAV sun siringà in del microinietur (Narishige) cun siringh manual (Narishige) en un periud de presiun de 20 finestra de minuti. Dopu l’infusiun, mett el capilar per 10 minut ancamò per permett che el virus se spantega cumpletament. Despœ qe i capillar inn staits retirads, la pell l’è suturada cont atenzion per minimizar l’inflamazion dei feride e permeter a l’animal de recuperar-s. I animai sun stà tratà cun analgesich (caspofen) per tanti dì dopu l’operaziun, durant el temp luur condiziun fisich sun stà atentament monitorà e dopu sun stà eutanizà al mument indicà. Tüt i procedür sun stà fatt segond i linee guida europee, naziunai e istituziunai e sun stà apruvà de LandesamtfürNatur de Umwelt e de Verbraucherschutz, Renania del Nord-Westfalia, Germania.
I animai sun stà anestetizà cun ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e el cœur l’è stà perfus cun 0,1 M PBS prima e dopu cun 4% PFA en PBS. El tessü l’è stà desseziunà e fissà in del 4% PFA/PBS durant la nott a 4°C. Un cutel vibrant (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) l’è stà duperà per preparar seziun sagital (spess 50 μm) del cervel fiss in PBS. A meno che l’è minga specificà altriment, la coloraziun di seziun a liber flottant l’è stada fada cuma descrivuu de sora (13) a temperadüra ambient e mes’ciand. En curt, prima, i fett ottenü sun stà permeabilizà cun 0,5% Triton X-100/PBS per 15 minut a temperadüra ambient; per quai epitop (Pcx e Shmt2), travers de un tampon tris-EDTA a 80°C (PH 9) scaldar i fett per 25 minut al post de chestu passagg. Sucesivament, i seziun sun stà incubà cun anticorp primari (varda Tabela S1) en tampon de blocch (3% BSA/PBS) a 4°C durant la nott cun mes’ciadura. El dì dopu, i seziun sun stà lavà cun tampon de blocch e incubà cun l’anticorp segondari coniugà a fluorofor aproprià per 2 our a temperadüra ambient; finalment, i seziun sun stà ben làvà en PBS, cuntraculurà cun DAPI e dopu fissà cun AquaPolymount Sü una vetrina de miscoscopio.
Per imaginar el campiun l’è stà duperà un miscoscopi cunfucal a scansiun laser (TCS SP8-X o fœuj de lüs digital TCS, Microsistem Leica) dotà de un laser a lüs bianca e de un laser ültraviulett a diod 405. Ecitand el fluorofor e raccògnind el segnal cunt el rilevadur ibrid (HyD), el software LAS-X l’è stà duperà per raccògnir imagen impilà cunfurm al campiunament de Nyquist en modalità sequenzial: per i panei minga quantitatif, se trata di segnai parècc dinamich (par esempi, en celùl somatich e dendrit) de PDN a UFPY Modalità BrightR). El gating de 0,3 a 6 ns l’è aplicà per redüss el sfund.
Imaging en temp real di celùl urdinà. Dopu l’urdinament en mez Neurobasal-A che g’ha denter l’1% de suplement B27 e 0,5 mM de GlutaMax, i celùl sun stà subit sementà sü di vetri rivestii de poli-l-lisina (μ-Vetri8 Poz, Ibidi, nümer de catalogh 80826) , e dopu mantegnil a 1% de CO2 a 3 per stabilirse. L’imaging en temp real l’è stà fatt sü un miscoscopi cunfucal a scansiun laser Leica SP8 dotà de un obietif a oli laser bianch, HyD, 63×[1,4 apertura numerich (NA)] e de un palch de riscaldament.
El rat l’è stà anestetizà rapidament cun anidrid carbonich e decapità, el cervel l’è stà rapidament cavà del cran e tajà en seziun sagital spess de 200 μm (per l’esperiment de etichetagg Fiton 13C) o spess de 275 μm (per dü esperiment de foton) riempì cunt i materiai crece-M, Scientific, Walldorf, Germania) l’è riempì di sustanz seguent: 125 mM frècc cuma giass, saturà en carbonio (95% O2 e 5% CO2) bas Ca2 + liquid cerebrospinal artificial (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de sodi m2, 1,25 mM tampon de sodi m2, 1,25 mM tampon de sodi m52. glucosio, 0,5 mM CaCl2 e 3,5 mM MgCl2 (presiun osmotica de 310 a 330 mmol). Trasferir i fett cerebral ottenü en una cambra de pre-incubaziun che g’ha denter Ca2 + ACSF püsee volt (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio mM Ca20, 25,0 mM d-glucosio MgCl2) Medio) pH 7,4 e da 310 a 320 mmol).
Durant el prucess de imaging, i fett sun stà spustà en una stanza dedicada a imaging e l’esperiment l’è stà fatt sotta perfusiun cuntinua de ACSF a una temperadüra custant de 32° a 33°C. Un miscoscopi a scansiun laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Microsistem Leica) dotà de una lent ubietiva Leica 25x (NA 0,95, aqua), laser Ti: Zaffiro (Cameleon Vision II, Coerent) l’è stà duperà per l’imaging a fett. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. I cambiaments ind el stat de ossid-reduzion citoplasmatega dei PN inn staits mesurads de FLIM a duu foton in fete cerebrai sajital, indov qe el biosensor Grx1-roGFP2 l’ha mirad ai PN. In del strat PN, el camp de acquisiziun l’è seleziunà de circa 50 a 80 μm sotta la superfiss de la fetta per garantir che g’he un PN vital (cioè la mancanza de strütüra a perlin o de cambiament morfologich neuronal luungh i dendrit) e el sensur roGFP2 pusitif pusitif e la codificaziun PCx-RNA de cuntrol o shRNA mCiliegia). Raccògli imagen a pila singula cun zoom digital 2x [luungheza d’unda de ecitaziun: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Rilevament: HyD intern, grupp de filter de isotiocianat de fluoresceina (FITC)] e la media del imagen en 2 o 3 minut sun duperà per garantir che sun cattà sü sufisent foton (1000 foton en tutal) per l’adattament de la cürva. La sensibilità de la sunda Grx1-roGFP2 e la verifica di cundiziun FLIM sun stà fatt monitorand el valur de durada de vida de roGFP2 quand che l’è stà giuntà H2O2 esogen 10 mM a la perfusiun ACSF (per massimizar l’ossidaziun, cunt el resultà de un aument de la durada de vida del m2). reduziun, cunt el resultà de una diminuziun de la durada) (Figura S8, D a G). Duperà el software FLIMfit 5.1.1 per analizar i resultà acquisì, adatar la singul cürva de decadiment espunenzial del intera imagen al IRF misurà (funziun de rispòsta del strüment) e χ2 l’è circa 1. Per calculà la durada de vida de un singul PN, la mascherina l’era manualment la durada de vida de ogni maschèra intorn al nerv. duperà per la quantificaziun.
Analisi del putenzial mitocondrial. Dopu che la seziun acuta l’è stada incubada cun 100 nM TMRM diretament giuntà al ACSF perfus per 30 minut, i cambiament putenziai mitocondriai di PN sun stà mesurà cunt un microscopi a dü foton. L’imaging TMRM l’è stà fatt eccitand la sunda a 920 nm e duperand HyD intern (isotiocianat de tetrametilrodamina: 585/40 nm) per cattà sü segnai; duperand l’istess luungheza d’unda de ecitaziun ma duperand un HyD intern diferent (FITC :525/50) per imaginar mtYFP. Dupera el plug-in Calculatur de imagen de ImageJ per valutar el putenzial mitocondrial a nivell de celùla singula. En curt, l’equaziun plug-in: segnal = min (mtYFP, TMRM) l’è duperada per identificar la regiun mitocondrial che mustra el segnal TMRM en somali de Purkinje in del imagen cunfucal a pila singula del canai curispundent. Donca l’area di pixel in de la maschera risultant l’è quantificada e pœu nurmalizada sü l’imagen a pila singula de limit curispundent del canai mtYFP per ottener la fraziun mitocondrial che mustra el putenzial mitocondrial.
L’imagin l’è stada deconvoluda cunt el prugrama Huygens Pro (Imagin scientifich del volum). Per i imagen scansionà di tessellin, el muntagg de un singul tessellin l’è fatt duperand l’algoritmo de cucidüra automatich furnì del software LAS-X. Dopu la calibraziun del imagen, dupera ImageJ e Adobe Photoshop per elaborà ulteriorment l’imagin e regular en mod uniforme la luminüsità e el cuntrast. Dupera Adobe Illustrator per la preparaziun grafich.
Analisi del focus mtDNA. El numer de lesion mtDNA l’è stait quantifegad su sezion cerebellar etiqetade cont anticorp contra l’ADN cont un microscopi confocal. Ogni area mira l’è stada creada per el corp celùlar e el nucleo de ogni celùla e la respetiva area l’è stada calculada duperand el plug-in Multi Measure (software ImageJ). Cavar l’area nuclear de l’area del corp celùlar per ottener l’area citoplasmatich. Finalment, el plug-in Analizar particel (software ImageJ) l’è stà duperà per quantificar automaticamente i punt de ADN citoplasmatich che indican l’ADN mt sül imagen de limit e i resultà ottegnü sun stà nurmalizà a la media PN di ratt CTRL. I resultads inn espress comè el numer medi de nucleosids per cellula.
Analisi de l’espression proteica. Duperà el plug-in Calculatur de imagen de ImageJ per valutar l’espresiun proteich en PN a nivell de celùla singula. In curt, ind l'imajen confocal a un strat del canal corispondent, a travers l'equazion : segnal = min (mtYFP, anticorp), l'è identifegada la rejon mitocondrial qe la mostra imunoreativitaa a un cert anticorp in Purkina. Donca l’area di pixel in de la maschera risultant l’è quantificada e dopu nurmalizada sü l’imagin a pila singula de limit curispundent del canai mtYFP per ottener la fraziun mitocondrial de la proteina visualizà.
Analis de la densità celùlar de Purkinje. El plug-in del cuntador celùlar de ImageJ l’è stà duperà per valutar la densità de Purkinje dividend el nümer de celùl de Purkinje cuntà per la luungheza del anel cerebellar ocupà di celùl cuntà.
Preparaziun e raccòlta del campiun. I cervell del grupp de cuntrol e di ratt Mfn2cKO sun stà fissà in del 2% de PFA/2,5% de glutaraldeid in del tampon fosfà 0,1 M (PB), e dopu sun stà preparà di seziun coronai duperand cilià (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Tampon de spessur 50 a PBn 60). tetrassido e 1,5% de ferrocianuro de putassi a temperadüra ambient per 1 ora. I seziun sun stà lavà tri volt cun aqua distilada e dopu culurà cun etanol al 70% che g’ha denter l’1% de acetà de uranil per 20 minut. I seziun sun stà pœu desidrà en alcol graduà e incorporà en resina epossidich Durcupan ACM (resina de fusiun de araldita M) (Scienzi de la microscopia eletronica, nümer de catalogh 14040) intra vetri de veder rivestii de silicio e a la fin a 60°C polimerizà in del forn. L’area de la cortecc cerebellar l’è stada seleziunada e seziun ultrasut de 50 nm sun stà tajà sü Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) e cattà sü una griglia de fessura de ram de 2 × 1 mm rivestida de film de polistirene. I seziun sun stà culurà cunt una soluziun de acetà de uranil al 4% en H2O per 10 minut, làvà cun H2O tanti volt, dopu cun citrat de plomb Reynolds en H2O per 10 minut e dopu làvà cun H2O tanti volt. I micrograf sun stà fatt cunt un miscoscopi eletronich de trasmisiun Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stat Ünì) duperand una fotocamera digital TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Germania).
Per i rats infetads de AAV, el cervell l’è stait separad e tajad ind una sezion sajital spessa de 1 mm, e el cervell l’è stait esaminad cont l’utilizar un microscopi a fluorescenza per identifegar l’anell infetad de AAV (çoè l’espression de mCherry). Sun duperà sultant i esperiment induè l’inieziun AAV la mena a un’eficienza de traduziun volta tant del strat celùlar de Purkinje (cioè quasi tüt el strat) en almenu dü anei cerebellar consecutif. El ciclo trasdott de AAV l’è stà microdisseziunà per la post-fissaziun durant la nott (4% PFA e 2,5% glutaraldeid en tampon de cacao 0,1 M) e ulteriorment elaborà. Per l’incorporaziun EPON, el tessü fiss l’è stà lavà cun 0,1 M de tampon de cacao de sodi (Applichem) e incubà cun 2% de OsO4 (os, Servizi scientifich; Caco) en tampon de cacao de sodi de 0,1 M (Applichem) 4 our, dopu lavaa per 2 our. Ripeter 3 volt cun tampon de cocamide 0,1 M. Dopu, la seri ascendent de etanol l’è stada duperada per incuba ogni soluziun de etanol a 4°C per 15 minut per disidratar el tessü. El tessü l’è stà trasferì en ossid de propilen e incubà durant la nott in EPON (Sigma-Aldrich) a 4°C. Mett el tessü en EPON frèsch a temperadüra ambient per 2 our, e dopu incorporal a 62°C per 72 our. Dupera un ultramicrotom (Leica Microsystems, UC6) e un cutel a diamant (Diatome, Biel, Svizzera) per tajar seziun ultrasutil de 70 nm e culurar cun acetà de uranil al 1,5% per 15 minut a 37°C e culurar cun soluziun de citrà de plomb 4 minut. I micrograf eletronich sun stà fatt duperand un microscopi eletronich a trasmissiun JEM-2100 Plus (JEOL) dotà de una fotocamera OneView 4K a 16 bit (Gatan) e de un prugrama DigitalMicrograph (Gatan). Per l’analìs, sun stà acquisì i micrograf eletronich cun zoom digital de 5000 × o 10.000 ×.
Analisi morfolojega dei mitocondri. Per tüt i analìs, i cürvi di singul mitocondri sun stà delineà manualment en imagen digital duperand el software ImageJ. Se analizen divers parameter morfolojeg. La densità mitocondrial l’è espress cuma una percentual ottenüda divident l’area mitocondrial total de ogni celùla per l’area del citoplasma (area del citoplasma = area celùlar-area del nucleo celùlar) × 100. La rundunità di mitocondri l’è calculada cun la furmula [4π∙2(area)]./perimeter. La morfolojia ista dei mitocondri l’è staita analizada e dividuda in duu categorie (“tubolar” e “bolla”) a segonda dei so forme principai.
Numer de autofagosoma/lisosoma e analisi de densità. Duperà el prugrama ImageJ per deliniar manualment i cürvi de ogni autofagosoma/lisosoma in del imagen digital. L'area de l'autofagosoma/lisosoma l'è espressa comè una percentual calcolada col divider l'area total de la strutura de l'autofagosoma/lisosoma de ogni cellula per l'area del citoplasma (area del citoplasma=area cellulara-area del nucli) × 100. La densitaa dei autofagosoma/lisosoma l’è calcolada col divider el numer total per el numer de struture de autofagosoma/lisosoma per cellula (in termen de area citoplasmega) (area citoplasmega = area cellulara-area nuclear).
Etichettadüra per la seziun acuta e la preparaziun del campiun. Per i esperiment che dumandan l’etichettadüra del glucosio, trasferir i fett cerebral acut en una cambra de pre-incubaziun, che g’ha denter carboni saturà (95% O2 e 5% CO2), volt Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de sodi m3O, fosfat de sodi 1,25 mM. 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl 2 e 2,0 mM MgCl 2, regulà a pH 7,4 e 310 a 320 mOsm), induè el glucosio l’è 13 C 6- Sostituziun del glucosio (Eurisotop, numer de catalog CLM9-1). Per i esperiment che dumandan l’etichettadüra cun piruvad, trasferir i fett cerebral acut a Ca2 + ACSF püsee volt (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfà de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio Ad2C e 100 mM). MgCl2, ajustar a pH 7,4 e 310 a 320mOsm) e giontar 1mM de piruvato 1-[1-13C] (Eurisotop, numer de catalogh CLM-1082). Incubà i seziun per 90 minut a 37°C. A la fin del esperiment, i seziun sun stà làvà rapidament cunt una soluziun aquosa (pH 7,4) che g’ha denter 75 mM de carbonat de amonio e dopu omogeneizà en acetonitril (ACN) 40:40:20 (v:v:v): metanol: aqua. Dopu che i seziun sun stà incubà sü giasc per 30 minut, i campiun sun stà centrifugà a 21.000 g per 10 minut a 4°C e el süpernatant ciar l’è stà secc en un cuncentratur SpeedVac. El pellet de metabolit secc risultant l’è stà cunservà a -80°C fin a l’analìs.
Analis de spettrometria de mass cromatografia liquid de 13 aminoacid marcad cun C. Per l’analìs de cromatografia liquid-spettrometria de mass (LC-MS), el pellet del metabolit l’è stà risuspendü en 75μl de aqua de qualità LC-MS (Honeywell). Dopu la centrifugaziun a 21.000 g per 5 minut a 4°C, 20 μl del süpernatant chiarid sun stà duperà per l’analìs del fluss aminoacid, menter el rest del estratt l’è stà duperà subit per l’analìs anionich (varda sotta). L’analis di aminoacid l’è stada fada duperand el protocoll de derivatizaziun del clorur de benzoil descrivuu prima (55, 56). In del prim pas, 10 μl de carbonat de sodi 100 mM (Sigma-Aldrich) sun stà giuntà a 20 μl de estratt de metabolit e dopu 10 μl de clorur de benzoil al 2% (Sigma-Aldrich) sun stà giuntà al ACN de grad LC. El campiun l’è stà vortexà per pooch temp e dopu centrifugà a 21.000 g per 5 minut a 20°C. Trasferir el suranatant nettà en una fiala autocampionadur de 2 ml cunt un insert de veder conich (volum de 200 μl). I campiun sun stà analizà duperand el sistèm LC (Waters) a volt rendiment Acquity iClass culegà al spettrometer de mass a volta risoluziun (Thermo Fisher Scientific). Per l’analìs, 2 μl del campiun derivà sun stà siringà en una culonn de sílice T3 a volta resistenza de 100 × 1,0 mm (Acque) che g’ha denter partisel de 1,8 μm. El fluss l’è de 100μl/min e el sistèm de tampon l’è furmà de tampon A (10 mM de furmà de amonio e 0,15% de acid formich en aqua) e de tampon B (ACN). El gradient l’è el seguent: 0%B a 0 minut; 0%B. 0 a 15% B a 0 a 0,1 minut; 15 a 17% B a 0,1 a 0,5 minut; B al 17 al 55% a 0,5 a 14 minut; B al 55 al 70% a 14 a 14,5 minut; a 14,5 a 70 a 100% B a 18 minut; 100% B a 18 a 19 minut; 100 a 0% B a 19 a 19,1 minut; 0% B a 19,1 a 28 minut (55, 56). El spettrometer de mass QE-HF funziuna en modalità de ionizaziun pusitif cunt un interval de mass de m/z (raport mass/carica) de 50 a 750. La resoluziun aplicà l’è de 60.000 e l’ubietif ionich de cuntrol del guadagn (AGC) ottegnuu l’è 3×106 e el temp ionich massim l’è millico1. La surgent de ionizaziun a eletrospray riscaldada (ESI) funziuna a una tensiun de spray de 3,5 kV, a una temperadüra capillar de 250°C, a un fluss d’aria de la ranza de 60 AU (unità arbitrari) e a un fluss d’aria ausiliar de 20 AU. 250°C. La lent S l’è impostada sü 60 AU.
Analis cromatografia anionich-MS di acid organich marcad 13C. El restant precipitat de metabolit (55μl) l’è stà analizà duperand un sistèm de cromatografia ionica Dionex (ICS 5000+, termofisher scientifich) culegà a un spettrometer de mass QE-HF (termofisher scientifich). En curt, 5 μl de estratt de metabolit sun stà siringà en una culonna Dionex IonPac AS11-HC dotada de HPLC (2 mm × 250 mm, dimensiun di particèll 4 μm, Thermo Fisher Scientific) en modalità a ciclo parzial push-in cunt un raport de riempiment de 1. 4μm, scientifich termofisher). La temperadüra de la culona l’è mantegnüda a 30°C e l’autocampionadur l’è impostà a 6°C. Dupera un cartucc de idrossido de putassi fornì cun aqua deionizada per generà un gradient de idrossido de putassi travers el generatur de eluent. Separaziun di metabolit a un fluss de 380μl/min, aplicànd el seguent gradient: 0 a 3 minut, 10 mM KOH; da 3 a 12 minut, da 10 a 50 mM KOH; de 12 a 19 minut, de 50 a 100 mM KOH; 19 a 21 minuti , 100 mM KOH; de 21 a 21,5 minut, de 100 a 10 mM KOH. La culona l’è stada reequilibrada sotta 10 mM KOH per 8,5 minut.
I metabolit eluì sun cumbinà cunt un fluss de suplement de isopropanol de 150 μl/min dopu la culona e dopu dirett a un spettrometer de mass a volta resoluziun che funziuna en modalità de ionizaziun negativa. MS l’è drée a cuntrular l’interval de mass de m/z 50 a 750 cunt una resoluziun de 60.000. L’AGC l’è impostà sü 1×106 e el temp ionich massim l’è mantegnuu a 100 ms. La surgent ESI riscaldada l’era fatta funziunar a una tensiun de spruz de 3,5 kV. I olter impostaziun de la surgent ionich sun i seguent: temperadüra capilar 275°C; fluss de gas de ranza, 60 AU; fluss de gas ausiliar, 20 AU a 300°C e l’impostaziun de la lent S a 60 AU.
Analisi di dat di metabolit marcad 13C. Dupera el prugrama TraceFinder (versiun 4.2, termofisher scientifich) per l’analìs di dat del raport izotopich. L’identidà de ogni cumpost l’è stada verificà de un cumpost de riferiment afidabil e analizà indipendentement. Per fär l’analìs de arricchiment di izotop, l’area del cromatogramm ionich estratt (XIC) de ogni izotop 13C (Mn) l’è stada estratta de [M + H] +, induè n l’è el numer de carboni del cumpost mira, duperà per analizar i aminoacid o [ MH] + l’è duperà per analizar i anion. La precisiun de masa de XIC l’è minur de ciinch part per miliun e la precisiun de RT l’è de 0,05 minut. L’analìs de arricchiment l’è fatt calculand el raport intra ogni izotop rilevà e la suma de tüt i izotop del cumpost curispundent. Chesti raport sun dà cuma valur percentual per ogni izotop e i resultà sun espress cuma arricchiment percentual molar (MPE), cuma descrivuu prima (42).
El pellet de neuron cungelà l’è stà omogeneizà en metanol al 80% (v/v) frècc cuma giass, vortexà e incubà a -20°C per 30 minut. Vortex ancamò el campiun e mes’cià a +4°C per 30 minut. El campiun l’è stà centrifugà a 21.000 g per 5 minut a 4°C e dopu el süpernatant risultant l’è stà cattà sü e secc duperand un cuncentratur SpeedVac a 25°C per l’analìs sucesiva. Comè descrivuu de sora, l’analìs LC-MS l’è stada fada süi aminoacid di celùl urdinà. Duperant TraceFinder (versiun 4.2, scientifich Termo Fisher), l’analìs di dat l’è stada fada duperand la mass monoisotopich de ogni cumpost. La nurmalizaziun quantil di dati di metabolit l’è stada fada duperand el pachet software preprocessCore (57).
Preparaziun di fett. El rat l’è stà anestetizà rapidament cun anidrid carbonich e decapità, el cervel l’è stà rapidament cavà del cran e el cutèll vibrant pien de giass (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) l’è stà duperà per tajal en 300 a 375% de gas de carbonio. CO2) Bass Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de fosfat de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosio, 1,0 mM CaCl2 e 6,0 mM MgCl302. mOSm). Trasferir i fett cerebrai ottenü en una cambra che g’ha denter Ca2 + ACSF püsee volt (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM pH d-glucosio, 4,0 mM Ca32l mM) e da 310 a 320 mOSm). Cunservà i fett per 20 o 30 minut inscì che pœden vèss restaurà prima de registrar.
registraziun. Per tüt i registraziun l’è stà duperà un palch de miscoscopio dotà de una cambra de registraziun fisa e de un lent ubietif a immersiun en aqua 20x (Scientifica). I cellule putative de Purkinje inn staite identifegade de (i) la dimension del corp, (ii) la posizion anatomega del cervell e (iii) l'espression del jen segnalador fluoressent mtYFP. La pipetta a tocc cunt una resistenza a punta de 5 a 11 megohm l’è tirada fœura de un capilar de veder borosilicà (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, prudut scientifich, Hofheim, Germania) e de una pipetta urizuntal Strument (P-1000). Tüt i registraziun sun stà fatt del amplificatur npi ELC-03XS (GmbH eletronich npi, Tam, Germania), che l’era cuntrulà del prugrama Signal (versiun 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Regn Ünì). L’esperiment l’è stà registrà a un tass campionament de 12,5 kHz. El segnal l’è filtrà cun dü filter Bessel passa-curt cun frequenz de limit rispettivament de 1,3 e 10 kHz. La capacità de la membrana e de la pipeta l’è cumpensada del circuit de cumpens duperand l’amplificatur. Tüt i esperiment sun stà fatt sotta el cuntrol de una videocamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germania), che l’era cuntrulada del prugrama Hokawo (versiun 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germania).
Configuraziun e analìs de rutina de tüt i celùl. Subètt prima de la registraziun, impienir la pipeta cun la soluziun interna che g’ha denter i sustanz seguent: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconat de putassi, 10,0 mM Hepes (4,0 mM trifotesina GufanoTPM) (Na) e 10,0 mM fosfat de creatinina sun stà agiustà a pH 7,25 e la pressiun osmotich l’era de 290 mOsm (saccarosio). Subèt dopu avegh aplicà una forza de 0 pA per romp la membrana, l’è stà mesurà el putenzial de la membrana de ripòs. La resistenza d’entrada l’è mesürada duperand curent iperpolarizà de -40, -30, -20 e -10 pA. Mesüra l’entità de la rispòsta de tensiun e dupera la legg de Ohm per calculà la resistenza d’entrada. L’atività spuntanea l’è stada registrada en una morsa de tensiun per 5 minut e el sPSC l’è stà identificà e mesurà en Igor Pro (versiun 32 7.01, WaveMetrics, Lac Oswego, Oregon, Stat Ünì) duperand un script de riconosciment semiautomà. La cürva IV e la curent stazionari sun mesurà blocand la bateria a putenziai diferent (a partir de -110 mV) e aumentand la tensiun en pas de 5 mV. La produziun de AP l’è stada testada duperand una curent depolarizant. Brècc la celùla a -70 mV menter se aplicà un impuls de curent depolarizant. Regula la dimensiun del pas de ogni unità de registraziun separà (da 10 a 60 pA). Calcula la frequenza AP massima cuntand manualment i picch de impuls che causan la frequenza AP püsee volta. El limit AP l’è analizà duperand el segond derivà del impuls de depolarizaziun che prima scatena vun o püsee AP.
Configuraziun e analìs del tocc perfurà. Eseguir la registraziun di tocc perfurà duperand protocoi standard. Duperà una pipetta senza ATP e GTP che g’ha minga i ingredient seguent: 128 mM de gluconat K, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,1 mM de EGTA e 2 mM de MgCl2 e regulà al pH 7,2 (duperand KOH). L'ATP e el GTP inn omess de la soluzion intracellular per prevegnir una permeabilitaa miga controllada de la membrana cellulara. La pipeta del tocc l’è riempida cunt una soluziun interna che g’ha denter anfotericina (circa de 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) per ottener una registraziun del tocc perforà. L’anfotericina l’è stada dessolta en sulfossid de dimetil (cuncentraziun final: dal 0,1 al 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La concentrazion de DMSO drovada l’ha miga avud un efet significativ sui neuron studiads. Durant el prucess de perforaziun, la resistenza del canai (Ra) l’è stada monitorada en mod continuo e l’esperiment l’è stà cumensà dopu che l’ampieza de Ra e AP s’è stabilizada (20-40 minut). L’atività spuntanea l’è mesürada en una morsa de tensiun e/o de curent per 2 a 5 minut. L’analìs di dat l’è stada fada duperand Igor Pro (versiun 7.05.2, WaveMetrics, Stat Ünì), Excel (versiun 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Stat Ünì) e GraphPad Prism (versiun 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Stat Ünì). Per identificar i AP spuntane, l’è duperà el plug-in NeuroMatic v3.0c de IgorPro. Identificar automaticamente i AP duperand un cert limit, che l’è regulamentà individualment per ogni registr. Duperant l’interval de picc, determina la frequenza de picc cun la frequenza massima de picc istantaneo e la frequenza media de picc.
Isolament PN. Adatand-s al protocoll püblicà prima, i PN sun stà purificà del cervell del rat en un stadi specifich (58). En curt, el cervell l’è stà desseziunà e trità en mez de dissociaziun frècc cuma giass [senza HBSS Ca2+ e Mg2+, integrà cun 20 mM de glucosio, penicilina (50 U/ml) e streptomicina (0,05 mg/ml)], e dopu digerì el mez cun mgHC1steini / ml), papaina (16 U / ml) e desossiribonucleasi I (ADNasi I; 0,1 mg/ml)] Tratà per 30 minut a 30°C. Lavar prima i tessü en mez HBSS che g’ha denter mucus œuf (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e DNasi (0,1 mg/ml) a temperadüra ambient per prevegnir la digestion enzimatich, e dopu en mez HBSS che g’ha denter 20 mM de glucosio, recinant delicatament en HBmilin5 (0,05 mg/ml) e la DNasi (0,1 mg/ml) liberan celùl singul. La suspensiun celùlar risultant l’è stada filtrada travers de un filtro celùlar de 70μm, pœu i celùl sun stà pelletà per centrifugaziun (1110 rpm, 5 minut, 4°C) e risuspendü en mez de urdinament [HBSS, integrà cun 20 mM de glucosio, 20% de stremicina bovina) Sèrum, (0,05 mg/ml)]; valutar la faitibilità celùlar cun ioduro de propidio e regular la densità celùlar a 1×106 a 2×106 celùl/ml. Prima de la citometria a fluss, la suspensiun l’è stada filtrada travers de un filtro celùlar de 50 μm.
Citometro de fluss. La classificaziun celùlar l’è stada fada a 4°C duperand la macchina FACSAria III (Bioscienzi BD) e el prugrama FACSDiva (Bioscienzi BD, versiun 8.0.1). La suspensiun celùlar l’è stada urdinada duperand un ugel de 100 μm sotta una presiun de 20 psi a un ritm de ~2800 event/sec. Cuma i criteri tradiziunai de chiusura (dimensiun celùlar, discriminaziun bimodal e carateristich de dispersiun) pœden no garantir el giüst isulament de PN di olter tip de celùl, la strategia de chiusura l’è stabilida sü la bas del cunfront dirett del intensità YFP e del autofluorescenza in del mitoYFP+ ​​e in del mitoYFP de cuntrol. YFP l’è ecità iradiand el campiun cunt una linea laser de 488 nm e el segnal l’è rilevà duperand un filter passa-banda de 530/30 nm. Ind i rats mitoYFP+, la forza relativa del jen reportador Rosa26-mitoYFP l’è anca drovada per distinguer el corp neuronal e i framments de asson. El 7-AAD l’è ecità cunt un laser giall de 561 nm e rilevà cunt un filter passa-banda de 675/20 nm per escluder i celùl mort. Per separar i astrocit al stess temp, la suspensiun celùlar l’è stada colorada cun ACSA-2-APC, dopu el campiun l’è stà irradià cun una linea laser de 640 nm e l’è stà duperà un filter passa-banda de 660/20 nm per rilevar el segnal.
I celùl cattà sü sun stà pelletà per centrifugaziun (1110 rpm, 5 minut, 4°C) e cunservà a -80°C fin al üs. I rats Mfn2cKO e i so cuccin de nidia inn classifegads ind el medem dì per minimizar la variabilitaa procedurala. La presentaziun e l’analìs di dat FACS sun stà fatt duperand el prugrama FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Stat Ünì).
Comè menzionad sora (59), el PCR in temp real l’è drovad per isolar el DNA dei neuron ordenads per la sucessiva quantifegazion del mtDNA. La linearità e la sensibilità a limit sun stà inizialment testà cun l’esecuziun qPCR sü diferenti nümer de celùl. En curt, cattà sü 300 PN en un tampon de lisi furmà de 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 e proteinasi K (200 ng/ml) e incuba a 55°C per 120 minut. I celùl sun stà ulteriorment incubà a 95°C per 10 minut per garantir l’inativaziun cumpleta de la proteinasi K. Duperant una sunda TaqMan (Thermo Fisher) specifich per mt-Nd1, l’ADNmt l’è stà mesurà cun PCR semiquantitatif in del sistèm PCR Ficient en temp real 7900HT (Ther). Scienza, numer de catalog Mm04225274_s1), i jen mt-Nd6 (termofisher scientifeg, numer de catalog AIVI3E8) e 18S (termofisher scientifeg, numer de catalog Hs99999901_s1).
Preparaziun del campiun del proteoma. Riscaldant la soluziun a 95°C per 10 minut e sonicand, in del tampon de lisi [6 M clorur de guanidina, 10 mM cloridrato de fosfina tris (2-carbossetil), 10 mM cloracetamida e 100 mM tris-HC pellet en neuron cungelà]. Su Bioruptor (Diagenodo) per 10 minuti (30 segund de impuls / 30 segund de periud de pausa). El campiun l’è stà diluì 1:10 en 20 mM tris-HCl (pH 8,0), mes’cià cun 300 ng d’or de tripsina (Promega) e incubà durant la nott a 37°C per ottener una digestion cumpleta. El segond dì, el campiun l’è stà centrifugà a 20.000 g per 20 minut. El süpernatant l’è stà diluì cun acid formich al 0,1% e la soluziun l’è stada disalada cun StageTips autofatti. El campiun l’è stà secc en un strüment SpeedVac (cuncentratur Eppendorf püsee 5305) a 45°C e dopu el peptid l’è stà suspendü en acid formich al 0,1%. Tüt i campiun sun stà preparà cuntempuraneament de la stess persuna. Per analizar i campiun de astrocit, 4 μg de peptidi desalà sun stà etichettà cunt un etichett de massa en tandem (TMT10plex, nümer de catalogh 90110, scientifich Thermo Fisher) cunt un raport peptid/reagent TMT de 1:20. Per l’etichettadüra TMT, 0,8 mg de reagent TMT sun stà risuspendü en 70 μl de ACN anidro e el peptid secc l’è stà recostituì en 9 μl de 0,1 M TEAB (bicarbonat de trietilamonio), al qual sun stà giuntà 7 μl de reagent TMT en ACN. La cuncentraziun l’era del 43,75%. Dopu 60 minut de incubaziun, la reaziun l’è stada s’ciopà cun 2 μl de idrosilamina al 5%. I peptidi marcad sun stà cattà sü, secà, risuspendü en 200 μl de acid formich (FA) al 0,1%, dividù en dü e dopu desalà duperand StageTips autofatti. Duperant el cromatograf liquid ultra volt rendiment UltiMate 3000 (cromatograf liquid ultra volt rendiment UltiMate 3000), una di dü mità l’è stada fraziunada sü una culonn cromatografich Acquity de 1 mm x 150 mm riempida de partisel de C18 de 130Å1,7 μm. Termo Fisher scientifich). Separar peptidi a un fluss de 30μl/min, separar del 1% al 50% de tampon B per 85 minut cunt un gradient gradual de 96 minut, del 50% al 95% de tampon B per 3 minut, dopu 8 minut per el 95% de tampon B; El tampon A l’è al 5% ACN e 10 mM bicarbonat de amonio (ABC), e el tampon B l’è al 80% ACN e 10 mM ABC. Raccògli i fraziun ogni 3 minut e cumbinai en dü grupp (1 + 17, 2 + 18, ecc.) e seccai en una centrifuga a vœui.
Analis LC-MS/MS. Per la spettrometria de mass, i peptidi (numer r119.aq) sun stà separà sü una culonn analìtich PicoFrit de 25 cm e diameter interno de 75 μm (nœuva lent ubietiva, nümer de part PF7508250) dotada de 1,9 μm de mezz ReproSil-Pur-Cr12). EASY-nLC 1200 (termopescadur scientifich, Germania). La culona l’è stada mantegnüda a 50°C. I tampon A e B sun rispettivament 0,1% de acid formich en aqua e 0,1% acid formich en 80% ACN. I peptidi sun stà separà del 6% al 31% de tampon B per 65 minut e del 31% al 50% de tampon B per 5 minut cunt un gradient de 200 nl/min. I peptid eluì sun stà analizà sü un spettrometer de mass de fusiun Orbitrap (Scientifich Termo Fisher). La misuraziun m/z del precursur peptidich l’è fatt cunt una resoluziun de 120.000 in del interval de 350 a 1500 m/z. Duperant el 27% de energia de collision nurmalizada, el precursor püsee fort cunt un stat de carega de 2 a 6 l’è seleziunà per la scissiun de dissociaziun de la trapola C (HCD) a volta energia. El temp del ciclo l’è impostà sü 1 s. El valur m/z del ciapell peptidich l’è stà mesurà in de la trapola ionica duperand l’obietif AGC püsee piscinin de 5×104 e el temp de inieziun massim de 86 ms. Dopu la frammentaziun, el precursur l’è stà mettuu in de la lista di esclusiun dinamich per 45 s. I peptid marcads TMT inn staits separads su una colona PepMap de 50 cm e 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numer de catalog 164942) e i spettre de migrazion inn staite analizade su un spettrometer de mass tribrid Orbitrap Lumos comè spettrometer de mass tribrid Orbitrap Lumos comè spettrometer de mass a forma de volta equimetrich con Thermo Fisher Scientific) (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) funziuna a dü tensiun de cumpens de −50 e −70 V. MS3 seleziunà sü la bas del precursur de sincronizaziun l’è duperà per la misuraziun del segnal ionich de raport TMT. La separaziun di peptid l’è stada fada sü EASY-nLC 1200, duperand un’eluziun a gradient linear al 90%, cunt una cuncentraziun de tampon del 6% al 31%; el tampon A l’era 0,1% FA e el tampon B l’era 0,1% FA e 80% ACN. La culona analitich la funziuna a 50°C. Dupera FreeStyle (versiun 1.6, termofisher scientifich) per divider el file uriginal segunt la tensiun de cumpens FAIMS.
Identificazion e quantifegazion dei proteine. Duperant el mutur de ricerca integrà Andromeda, i dat uriginai sun stà analizà duperand la versiun 1.5.2.8 de MaxQuant. Olter ai sequenz de la ricombinasi Cre e YFP otegnuu de Aequorea victoria, sun stà cercà i spettr di ciapell peptidich per la sequenza canonich e la sequenza isofurma del proteoma de riferiment del rat (ID del proteoma UP000000589, scaricà de UniProt en magg2. L'ossidazion de la metionina e l'acetilazion N-terminal de la proteina inn staite fissade comè modifege variabei; la metilazion de la cisteina carbamoil l'è staita stabilida comè modifege fisse. I parameter de dijestiun sun impostà sü “specificità” e “tripsina/P”. El numer minim de peptids e peptids de rasor drovads per l'identificazion dei proteine ​​l'è 1; el numer minim de peptids uneg l’è 0. Ind i condizion de corispondenza de la mapa peptideg, el tass de identifegazion dei proteine ​​l’era de 0,01. L’opziun “Segond peptide” l’è abilitada. Dupera l’opziun “corrispondenza intra esecuziun” per trasferir identificaziun reussii intra diferenti file uriginai. Duperà el cuntegg del raport minim LFQ 1 per la quantificaziun senza etichett (LFQ) (60). L'intensitaa LFQ l'è filtrada per almanc duu valor valids in almanc un grup de jenotip a ogni pont de temp e l'è estrapolada de una distribuzion normal cont una larjeza de. 0,3 e spustà giò 1,8. Duperà la piattafurma informatich Perseus () e R (pruget) per analizar i resultà del LFQ. Un test t moderà a dü vias del pachet software limma l’è stà duperà per l’analìs de espresiun diferenzial (61). L’analìs di dat esploratif l’è fatt duperand ggplot, FactoMineR, fattoextra, GGally e pheatmap. I dati proteomich basà sü TMT sun stà analizà duperand la versiun MaxQuant 1.6.10.43. Cerca dei dats proteomeg grez del database proteomeg uman de UniProt, qe l’è stait scaricad ind el setember 2018. L'analisi la includ el fator de correzion de la pureza dei izotop fornid del produtor. Dupera limma en R per l’analis de espresiun diferenzial. I dat uriginai, i resultà de la ricerca del database e el fluss di lavurà e i resultà del analìs di dat sun tüt cunservà in del alleanza ProteomeXchange travers del archivi partner PRIDE cun l’identificatur del insema di dat PXD019690.
I anotaziun funziunal arricchisen l’analìs. El strüment Analisi del Percors de Ingegno (QIAGEN) l’è stà duperà per determinar la richeza di termin de anotaziun funziunal del insema di dat a 8 seteman (Figura 1). In curt, l’elenc quantitatif di prutein ottenü dal analìs di dat LC-MS/MS (spettrometria de mass en tandem) l’è duperà cunt i seguent criteri de filter: Mus musculus l’è seleziunà cuma spècc e sfund, e la categuria mustra che el valur P giüst de Benjamini per l’arrichiment de 0,05 o inferiur l’è cunsiderà significatif. Per chestu grafich, sun mustrà i ciinch categurì ecessif püsee volt en ogni cluster basà sul valur P giüst. Duperant plü test t, duperand el prugrama de slancio linear en dü stadi de Benjamini, Krieger e Yekutieli (Q = 5%), l’analìs del espresiun proteich in del curs del temp l’è fatt süi candidà impurtant identificà en ogni categuria e ogni riga l’è analizà separà. G’he minga bisogn de adutar un DS coerent.
Per cunfruntar i resultà de chestu stüdi cunt i database püblicà e generar un diagramm de Venn in de la figüra 1, g’hem cumbinà l’elenc quantitatif di prutein cunt i anotaziun MitoCarta 2.0 (24). Dupera el strüment online Disegna el diagramm de Venn (http) per generà el diagramm.
Per informazion detaiade sui procedure statistege drovade per l'analisi proteomiga, se riferiss a la sezion corispondenta de Materiai e Metud. Per tüt i olter esperiment, informaziun detaglià pœden vèss truvà in de la legenda curispundent. A men che l’è minga specificà olter, tüt i dat sun espress cuma media ± SEM e tüt i analìs statistich sun stà fatt duperand el prugrama GraphPad Prism 8.1.2.
Per i materiai suplementar per chestu articul, varda http://
Chestu l’è un articul a acess avèrt distribuì ai termin de la licenz de attribuziun-minga cumercial Creative Commons, che cunsent l’üs, la distribuziun e la riproduziun en qual-sa-vöör mezz, purché l’üs final l’è minga per un guadagn cumercial e la premesa l’è che l’oper uriginal l’è giüst. Riferiment.
Nota: Ti dumandem sultant de furnir el tò indiriz e-mail inscì che la persuna che te racumandi a la pagina la sa che te vœut che la veda l’e-mail e che l’è minga spam. Catturem no nissun indiriz e-mail.
Chesta dumanda l’è duperada per verificar se l’è un visitant e per evitar l’invio automatich de spam.
De E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomega dei neuron disfonzionai l'ha rivelad qe i programa metaboleg inn ativads per contrastar la neurodejenerazion.
De E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomega dei neuron disfonzionai l'ha rivelad qe i programa metaboleg inn ativads per contrastar la neurodejenerazion.
©2020 Asociaziun americana per el prugress de la scienza. tutti i diritti riservati. AAAS l'è un partner de HINARI, AGORA, OARE, COR, CLOCKSS, Riferiment incrocià e CONTADOR. Avanzament de la Scienza ISSN 2375-2548.