Indiriz atual: OX11 0DE, Regn Ünì, Diamond Building, Parc de la scienza e del inovaziun Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Regn Ünì, Diamond Light Source Co., Ltd., Centro de imaging biologich eletronich.
El compless de regoi de la lux del center de reazion 1 (RC-LH1) l’è el component fotosinteteg central dei bater fototrofeg viœla. G’hem introdott dü strütür de microscopia crioeletronich del cumpless RC-LH1 de la rodopseudomona palustris. La strutura a resoluzion de 2,65 Å del compless RC-LH114-W l’è costituida de 14 circoi de sotunitaa LH1 qe circonda RC, qe l’è intarompida de la proteina W, inscambi el compless senza proteina-W l’è completament una composizion RC circondada de RC. Ciclo LH1 de 16 sotunità sarad. El confront de qei struture qì al forniss una comprension su la dinamega de la chinona ind el compless RC-LH1, compres i cambiaments conformazionai precedentement indeterminads quand qe se liga el chinona ind el sit RC QB, tant’mè la posizion dei sits de ligament ausiliar del chinona, qe vuta a passar-i a RC. La strutura unega de la proteina W la prevegn la saradura del circol LH1, e la crea insì un canal per acelerar el scambi de quinona/chinolona.
L’energia furnida de la fotosintès pœu sustener quasi tüta la vida sü la terra e g’ha un grand putenzial per la biotecnologia sular. Intant qe promoven la fotosintesi global, i bater fototrofeg viœla mostren anca varie modalitaa de enerjia e capacitaa metabolege. I pœden evitar la fotosintesi e cresser comè bater eterotrofeg al scur, i pœden fissar azot e anidrid carbonega, produr idrojen e degradar i composts aromateg (1-3). Per dar-g enerjia a qests process, la lux la g’ha de vesser convertida in manera rapida e eficente in enerjia qimega. Chestu prucess cumencia quand el cumpless de l’antenna che trapola la lüs assorb la lüs e trasferiss l’energia intrapolada al center de reaziun (RC), cumenciand inscì la separaziun de la carica (4 – 7). L'unitaa de bas de la fotosintesi ind i bater fototrofeg viœla l'è componud de RC de tip 2, circondad del compless de regoi de la lux 1 (LH1), qe al forma el compless del nucli RC-LH1. LH1 l’è furmà de una seri de eterodimer αβ cürvi, ognun di quai lega dü molecul de clorofila baterich (BChl) e un o dü carotenoid (8-12). L'antena LH1 plussee semplix l'è costituida de 16 o 17 eterodimer αβ qe circonden el RC (9-13) ind un circol sarad, ma ind oltr compless nuclear, i peptids trasmembran interrompen la continuitaa del LH1 circostante, Promovend insì la difusion de quinol/chinona e compox bRC1, 13-15). La pianta fototrofich viola Rhodopseudomonas (Rps.) l’è un urganism mudel che pœu cumprender l’energia e el trasferiment de eletrun che suporta la fotosintès. La prima strutura de cristal de Rps. El modell del compless RC-LH1 del palustri l’è RC, circondad de 15 circoi LH1 eterodimereg, qe inn intarompids de una proteina miga cognossuda ciamada “Proteina W” (14). La proteina-W l’è staita pœ identifegada comè RPA4402, qe l’è una proteina miga caraterizada de 10,5 kDa cont tri eliqe trasmembrane (TMH) prevedude (16). Proponom de rinominar el jen rpa4402 qe codifega la proteina W in pufW per vesser coerent cont la nomenclatura drovada per i jen qe codifegen i sotunitaa RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). Curiosamente, la proteina-W l’è presenta domà ind el 10% incirca de RC-LH1, e la rivela Rps. palustris al produx duu compless RC-LH1 diferents. Chichinscì, riportam i strutur crio-EM (crio-EM) a volta resoluziun de dü cumpless nuclear, un cun proteina W e 14 eterodimer αβ, l’olter senza proteina W e un ciclo LH1 de 16 eterodimer sarà. La nostra strutura la rapresenta un cambiament de pas ind la comprension del compless RC-LH1 de Rps. palustris, perqè hem analizad la popolazion omojenia de ogni varianta e g’hem una resoluzion suficent per asegnar ciarament ogni peptid e pigments ligads e lipids e chinon correlads. El confront de qei struture qì al mostra qe i tri proteine ​​TMH-W qe inn staite miga trovade in nissun olter compless RC-LH1 infina adess i jeneren un canal de chinona per acelerar el scambi de chinona/chinona. Un cert numer de sits de ligament lipids e chinon conservads inn staits identifegads, e hem rivelad un nœv cambiament conformazional despœ de la combinazion de chinon e RC, qe al pœl vesser adeguad per el fotosistema II (PSII) RC de organism fototrofeg ossijenads. I nostre descoverte fornissen dei nœve informazion su la cinetega del legam e del scambi chinona/chinona ind el compless nuclear RC-LH1 dei bater fototrofeg viœla.
Per facilitar un stüdi detailà di dü cumpless truvà en Rps. palustris, isolam ogni RC-LH1 cun metud biochimich. El compless deficent de la proteina (in seguit indicad comè ΔpufW) l'è stait purifegad del cep senza el jen pufW (16) e domà un compless RC-LH1 al pœl vesser prodot. El compless qe al contegn la proteina W l'è prodot de un cep. La proteina W de qell cep qì l'è modifegada cont un tag His 10x a'l so terminal C, insì qe el compless qe al contegn la proteina W al pœl vesser efetivament combinad cont la major part dei proteine ​​W senza imobilizar el metal. El cumpless l’è separà (16) Cromatografia de afinità (IMAC).
Cuma mustrà in de la figüra 1, tüt i dü cumpless g’han denter tri sottaunità RC (RC-L, RC-M e RC-H) circondà de un’antenna LH1. La strutura 2,80-A del compless senza proteina-W la mostra 16 eterodimer αβ, qe la forma un circol LH1 sarad qe al circonda completament el RC, in seguit indicad comè compless RC-LH116. La strutura de 2,65 Å del compless qe al contegn la proteina-W la g’ha un LH1 a 14 eterodimer intarompid de la proteina-W, in seguit indicad comè RC-LH114-W.
(A e B) Rapresentaziun superficial del cumpost. (C e D) Pigments ligads espress in barre. (E e F) I compless osservads de la superfix citoplasmega g’hann i peptids e i sotunitaa LH1 rapresentads ind i carton animads, e inn numerads in sens orari del gap proteina-W [coerent cont la numerazion Rba. cumpless di sferoid (13)]. Per LH1-α, el color de la sotunitaa proteiga l’è jall; per LH1-β, el color de la sotunitaa proteiga l’è blu; per la proteina-W, la proteina l’è rossa; per RC-H, l’è cian; per RC-L, l’è Naranz; per RC-M, magenta. I cofator inn representads de barre, el verd al representa i molecole de BChl e BPh a, el viœla al representa i carotenoids e el jall al representa i molecole UQ10. (G e H) Vista ingrandida del gap proteina-W in de la regiun equivalent del cumpless RC-LH114-W (G) e del cumpless RC-LH116 (H). I cofatur sun mustrà sotta furma de riempiment del spazi, la chinona chelada l’è mustrada en blu. El gap proteina-W l’è evidenziad de una linea trategiada blu in (G) e i bux picinen indov qe la quinona/chinolol la se difond su l’anel LH116 inn evidenziade de una linea trategiada negra in (H).
La figura 1 (A e B) la mostra el RC circondad de matris avert o sarad de eterodimer LH1αβ, ognidun dei quai lega duu BChl e un carotenoid (Figura 1, C e D). I stüdi precedent g’han mustrà che Rps l’è el cumpless LH1. Ind la via biosintetega de la xantina de la spirulina, qei spece qì contegnen popolazion miste de carotenoids (17). Però, la spiropiroxantina l’è el carotenoid dominant e la sò densità l’è sudisfacent. Donca, g’hem scernid de modellar la spiroxantina in tuts i sits de ligament LH1. I polipeptids alfa e beta inn singoi TMH cont rejon esterne de membrana curta (Figura 1, A, B, E e F). Anca se la densitaa de 17 residui a la fin C l’è staita miga osservada, el polipeptid alfa l’è stait separad de Met1 a Ala46 in tuts duu i compless. El polipeptid β l’è stà redut de Gly4 a Tyr52 en RC-LH116 e de Ser5 a Tyr52 en RC-LH114-W. Nissüna densità de 3 o 4 residu N-terminal o 13 C-terminal l’è stada osservà (Figura S1). L'analisi de la spettrometria de massa del compless mist RC-LH1 preparad del cep selvateg l'ha mostrad qe la rejon mancanta l'era el resultad de una scissiun eterologa de qei peptids qì (Figura S1 e S2). L’è stada osservà anca la formilaziun N-terminal de α-Met1 (f). L’analis g’ha mustrà che el α-peptid l’è furmà de residu fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 e el β-peptid l’è furmà de residu Ser2 a Ala53, che l’è en bon acord cun la mapa de densità EM a bassa temperadüra.
La coordinazion de α-His29 e β-His36 la rend i BChl facia a facia; ogni eterodimer αβ al se assembla coi so vexin per formar un circol avert (RC-LH114-W) o un circol sarad (RC-LH116) intorn al RC La matris de pigments acopiads ai esciton (Figura 1, C e D). Rispett a la banda de 877 nm de RC-LH114-W, el spustament ross de assorbiment de 880 nm de RC-LH116 l’è de 3 nm (Figura 2A). Però, el spettru del dicroismo circular l’è asquas istess (Figura 2B), indicand qe anca se g’è una ciara diferenza intra circoi averts e sarads, l’ambient local dei BChl l’è simil tant. El spustament al ross del assorbiment pœu vèss el resultà de un muviment termich redot e de un’aument de la stabilità sül circol sarà (18, 19), el cambiament del accoppiament del pigment causà del circol sarà (20, 21), o una combinaziun de chesti dü efet (11).
(A) Spettro de assorbiment ultraviolett/visibil/quasi infraruss, i cui vètt sun segnà cunt i luur pigment curispundent e nurmalizà al vètt BPh a 775 nm. (B) Spettr de dicroismo circular nurmalizà al assorbiment de BChl a 805 nm. (C e D) Spettri ΔA seleziunà di spettri de assorbiment risolt en temp del cumpless RC-LH114-W (C) e del cumpless RC-LH116 (D). Per una mejior cumparabilità, tüt i spett sun nurmalizà a ∆A de −A a 0,2 ps. (E) El tass de ossidaziun del citocromo c2 dopu l’iradiaziun en presenza di vari cuncentraziun de UQ2 (vardà la figüra S8 per i dat grezz). (F) Ind i cellule cressude sota lux de bassa, media o volta intensitaa (rispettivament 10, 30 o 300μMm-2 s-1), i sotunitaa de la proteina W e RC-L ind el compless purifegad e el raport de la membrana separada. Determinar el nivell de proteina travers l’eletroforesi sü jel de poliacrilamida SDS e l’imunotest (varda la figüra S9 per i dat grezz). Determinar el raport rispett al cumpless RC-LH114-W purificà. El raport steiqiometreg de RC-L a proteina-W del compless l’è 1:1.
I BChl in de la posiziun 1 in del ciclo αβ14 defurmà de RC-LH114-W (Figura 1, A, C e E) sun püsee visin al donatur primari RC (P) de 6,8 Å rispett ai BChl equivalent en RC-LH116 (Figura 1, B, S3); però, la cinetich de assorbiment transitori di dü cumpless mostra che per RC-LH114-W e RC-LH116, i custant de temp de trasferiment de energia de ecitaziun de LH1 a RC sun 40 ±4 e 44±3 ps (Figura 2). , C e D, Figura S4 e Tabela S2). G’he anca no una diferenza significativa in del trasferiment eletronich denter de RC (Figura S5 e test suplementar culegà). Pensem che la strècc curispundenza del temp de trasferiment de energia intra LH1 e RC-P l’è dovüda a la distanza, al angul e a l’energia putenzial simil de la magiur part de BChl en i dü circoli LH1. El par che esplurar el mudel energètich LH1 per rivà a la distanza minima l’è minga püsee veloce del trasferiment dirett de energì di sit subottimal a RC. El circol LH1 a ciclo avert in RC-LH114-W al pœl anca subir un moviment termeg insignificant in condizion de bassa temperadura per l’analisi strutural, e la g’è una conformazion de anell αβ14 plussee longa a temperadura ambiental de la distanza de pigmentazion dei βBChl ind la posizion de RC 1.
El cumpless RC-LH116 g’ha denter 32 BChl e 16 carotenoid e la sò disposiziun cumplesiva l’è istess a chela ottenüda dal pidpidum del termocromatio (Tch.) (12) e alghe verd (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Dopu l’allineament, sun stà osservad sultant deviaziun piscinin en i posiziun di eterodimer αβ, en particular 1-5, 15 e 16 (Figura S6). La presenza de la proteina-W la g’ha un impat significativ su la strutura de LH1. I so tri TMH inn collegads de circoi curts, cont el N-terminal sul lat del lumen del compless e el C-terminal sul lat citoplasmeg (Figure 1A e 3, A a D). La proteina-W l’è per la plupart idrofoba (Figura 3B), e TMH2 e TMH3 interajissen cont LH1αβ-14 per formar una superfix trasmembrana (Figura 3, B e E a G). L'interfaça l'è principalment composta de residui Phe, Leu e Val ind la rejon trasmembrana. Qei residu qì inn impilads cont aminoacids idrofobeg e pigments αβ-14. Un quai residu polar al contribuiss anca a l'interazion, compres el ligam de idrojen intra W-Thr68 e β-Trp42 su la superfix de la cavitaa complessa (Figura 3, F e G). Su la superfix del citoplasma, el Gln34 l’è vexin a’l grup cheto dei carotenoids αβ-14. De soraplu, la molecola de n-dodecil β-d-maltosid (β-DDM) l’è staita risolta, e la soa coa idrofoba la s’è estesa a l’interfaça intra la proteina-W e αβ-14, e la coa lipidega la pœl vesser situada ind el corp. Num hem anca notad qe i rejon de resoluzion C-terminal de la proteina W e RCH inn vexine fiss, ma miga ind el ambit de la formazion de interazion specifege (Figura 1, A e E). A bon cunt, g'è dei interazion ind i aminoacids C-terminai miga resolts de qei duu proteine ​​qì, qe pœden fornir un mecanism per el reclutament de la proteina-W durant l'assemblaj del compless RC-LH114-W.
(A) La proteina-W, che la varda sü l’interfacia cun LH1αβ14 en furma de disegn, g’ha una cadena lateral a furma de verga (ross), mustrada en una part del diagramm del putenzial eletrostatich (superfiss gris trasparent cunt un livel de cürva de livel de 0,13). (B) Proteina-W rapresentada de una superfiss culurada idrofoba. I aree polar e carege a i henn mostrade in cian, i aree idrofobe inn mostrade in bianc e i aree fortement idrofobe inn mostrade in naranz. (C e D) Proteina-W rapresentada in del disegn, el sò urientament l’è istess che en (A) (C), e rotà de 180° (D). Segond la posizion ind la sequenza, i residu distinguibil adoten un sqema de color arc in ciel, indov qe el N-terminal l’è blu e el C-terminal l’è ross. (E) Proteina-W ind l’istessa vista de (A), e i residu a l’interfaça de la proteina-W:LH1 inn representads de barre cont segn tacads. (F) La proteina-W l’è rotada de 90° rispett a (E) e a LH1αβ14 in de la rapresentaziun del disegn e rispett ai residu del interfacia in de la rapresentaziun a barra. I residu sorapendeds del polipeptid beta inn etiqetads. El cofatur l’è mustrà cuma una barra che currispunt al culur de la figüra 1, el β-DDM decompost l’è mustrà en gris e l’usigen l’è mustrà en ross. (G) La vista en (F) l’è rutada de 180°, cunt i residu prominent del polipeptid alfa etichettà.
La proteina-W la sostituiss un eterodimer αβ (el 15° ind la figura 1F), la prevegn insì la saradura del circol e l'inclinazion dei prim tri eterodimer αβ. L’è stà osservà che l’angul de inclinaziun massim del prim eterodimer αβ-1 rispett al nurmal del film l’era de 25° a 29° (Figura 1, A e E), che l’è stà furmà del inclinaziun de 2° a 8° de αβ-1 en RC A cuntrast fort-LH116 e F (Figura 1, B). El segond e el terz eterodimer sun inclinà rispettivament de 12° a 22° e de 5° a 10°. A causa de l’ostacul sterich de RC, l’inclinaziun de αβ-1 includ no la segonda còppia de αβ (che la curispunt al 16° αβ in de la figüra 1F), furmand inscì un spazi ciar in del anel LH1 (figüra 1, A e E) . A causa de la mancanza de duu eterodimer αβ, compagnads de la perdita de quatr BChl e duu carotenoids, nissun dei carotenoids al se lega a la sotunitaa αβ-1 torçada, cont el resultad de un anell LH114-W qe al contegn 13 carotenoids vegetarian e 28 BChl. I stim de resoluzion local dei duu compless ind i rejon αβ1 a 7 inn plussee basse de qei del rest del circol LH1, qe al pœl rifleter la plastega inerent a la sotunitaa LH1 vexina al sit RC QB (Figura 4) .
I imagen de RC-LH114-W (A e B) e de RC-LH116 (C e D) sun mustrà de la stess vista superiur/lateraal (A e B) (A e C) e de la superfiss de la cavità de la Fig. 1. (B e D). I tast culurà sun mustrà a destra.
L’uneg olter compless nuclear carateristeg cont un raport steiqiometreg de 1:14 l’è el dimer RC-LH1-PufX del rodococ sferoid (Rba.) (13). Comesessia, la proteina W e PufX i g'hann no un'omolojia ovvia e i g'hann un impat significativ sui so respetive struture LH1. El PufX l’è un singol TMH cont un domini citoplasmeg N-terminal qe l’interajiss cont el lat citoplasmeg de la sotunitaa RC-H (13) ind una posizion corispondent a Rps. lH116αβ-16. El PufX al crea un canal per el scambi de quinona/chinolona intra RC-LH1 e el compless citocrom bcl e l’è present in tuts i Rba. cumpless del nucleo di sferoid (13). Anca se l’interfacia monomer-monomer l’è in Rba. El dimer RC-LH1-PufX dei sferoids al se trœva ind la posizion de ligament de la proteina W ind el RC-LH114-W, e el gap indot de PufX e de proteina-W l’è ind una posizion equivalente (Figura S7A). El gap in RC-LH114-W l’è anca allinead cont l’ipoteteg canal de chinona (8) del Pseudomonas rosa LH1, qe l’è formad de peptids miga ligads a la proteina W o a la PufX (Figura S7B). Ancamò, el canal de chinona in Blc. El LH1 verd smeraldo formad escludend una sotunitaa γ (7) al se trova ind una posizion simil (Figura S7C). Anca se mediada de proteine ​​diferente, la comparsa de qei canai chinona/chinolol qì ind una posizion comuna ind el compless RC-LH1 la par vesser un esempi de evoluzion convergent, qe l'indica qe el gap cread de la proteina W al pœl ajir comè un canai chinona.
El spazi ind el circol LH114-W al permet la formazion de una rejon de membrana continua intra el spazi intern del compless RC-LH114-W e la membrana de massa (Figura 1G), plutost qe collegar i duu domini a travers de un por proteig comè ind i proteine. El cumpless RC-LH116 l’è simil a un Tch sarà. Cumpless simil a aguja (22) (Figura 1H). Dejà qe la difusion de la chinona a travers la membrana l’è plussee veloç de la difusion a travers el canal proteig streit, el circol LH114-W avert al pœl permeter un rotazion RC plussee rapida qe el circol LH116 sarad, e la difusion de la chinona ind el RC la pœl vesser plussee limitada. Per verificar se la proteina W l’influiss sü la cunversiun di chinoni a travers RC, g’hem fatt un test de ossidaziun del citocrom sü una certa cuncentraziun de ubichinona 2 (UQ2) (un analogh de UQ10 natüral cunt una cua de isoprene püsee cuurta) (Figura 2E). Anca se la presenza de chinona chelada l’impediss la determinaziun precisa de la custant aparent de Michaelis (RC-LH114-W e RC-LH116 sun adattà rispettivament a 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM), el tass massim de RC-LH114-6-1. 28±5% magiur de RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Inizialment g’hem stimà che la proteina-W l’è present in del 10% circa del cumpless nuclear (16); chichinsci, i tass de ocupaziun di celùl de cressita a bassa lüs, media lüs e volta lüs sun rispetivament 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5 % (Figura 2F). El confront quantitativ de la spettrometria de massa l’ha mostrad qe l’adizion de l’eticheta de istidina l’ha miga redot l’abundanza relativa de proteina-W rispet ai cep selvateg (P = 0,59), donca qei nivei qì inn miga un artefat de proteina-W modifegada (Figura S10). Comesessia, qella bassa ocupazion qì de la proteina-W ind el compless RC-LH1 la pœl permeter a un quai RC de cambiar a un ritm acelerad, mitigand insì el scambi plussee lent de quinona/chinolona ind el compless RC-LH116. G’hem notad qe l’olt tass de ocupazion de la lux l’è incoerent coi recent dats trascritomig, qe l’indica qe l’espression jenega pufW l’aumenta sota lux forta (Figura S11) (23). La diferenza intra la trascrizion pufW e l'incorporazion proteina-W ind el compless RC-LH1 l'è confusa e la pœl rifleter la regolazion complessa de la proteina.
In RC-LH114-W, 6 cardiolipina (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilglicerœl (POPG) e 29 molecole β-DDM inn atribuide e modellade ind luu 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG e 12. RC-LH116 (Figura 5, A e B). In qei duu struture qì, el CDL al se trœva asquas sul lat citoplasmeg del compless, inscambi el POPC, el POPG e el β-DDM se trœven per la plupart sul lat luminal. Dü molecul lipidich e detergent sun stà isulà in de la regiun αβ-1 a αβ-6 del cumpless RC-LH114-W (Figura 5A), e ciinch sun stà isulà in de la regiun equivalent de RC-LH116 (Figura 5B). Plussee lipids inn staits trovads de l’oltra banda del compless, principalment CDL, accumulads intra RC e αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A e B). Oltr lipids e detergents struturalment risolts se trœven fœra de l'anell LH1, e i cadene acile ben risolte se estenden intra i sotunitaa LH1, provisoriament designade comè β-DDM in RC-LH114-W, e definide comè β-DDM in RC Una mescolanza de βPOPC-HDLDM e 16. I posizion simil dei lipids chelants e dei detergents ind la nostra strutura indiqen qe inn sits de ligament fisiolojegament relevants (Figura S12A). I posizion dei molecole equivalent in Tch g’hann anca una bona coerenza. Gentil e Trv. I cep 970 RC-LH1 (Figura S12, B a E) (9, 12) e i residu de ligam a idrojen del grup de la testa lipidega hann mostrad una conservazion assée bona ind l'alineament de la sequenza (Figura S13), qe l'indica qe el CDL conservad qe al se lega a RC (24), qei sits qì pœden vesser conservads in CHDL1.
(A e B) I peptids RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) inn rapresentads de carton e i pigments inn rapresentads de barre, cont el sqema de color ind la figura 1. I lipids inn mostrads in ross, e i detergents inn mostrads in gris. UQ ligà ai sit RC QA e QB l’è giall, menter el UQ isulà l’è blu. (C e D) I stess punt de vista de (A) e (B), cunt i lipid omess. (E a G) Vista ingrandì de Q1(E), Q2(F) e Q3(G) de RC-LH116, cun caden laterai che influenzan intra luur. I ligam de idrojen inn mostrads comè linie tratejade nere.
Ind el RC-LH116, sia el RC QA qe el QB UQ, qe partecipen a’l trasferiment de eletron ind el process de separazion de la carega, se decomponen ind i so sits de ligament. Però, en RC-LH114-W, la quinona QB l’è minga stà risolta e la sarà afruntà en detagli in bas. Olter ai quinon QA e QB, duu molecole UQ chelade (situade intra i anei RC e LH1) inn allocade ind la strutura RC-LH114-W segond i so grup de cò ben risolts (situade rispetivament in Q1 e Q2). spazi). Figura 5C). Dü unità de isoprene sun asegnà a Q1 e la mapa de densità risolv i 10 cu de isoprene cumplet de Q2. Ind la strutura de RC-LH116, tri molecole UQ10 chelade (Q1 a Q3, Figura 5D) inn staite risolte e tute i molecole g’hann una densitaa ciara in tuta la coa (Figura 5, D a G). Ind i duu struture, i posizion dei grup de cò de quinon de Q1 e Q2 i g’hann una coerenza ecelent (Figura S12F), e interajissen domà cond RC. Q1 se truva a l’entrada del gap W de RC-LH114-W (Figura 1G e 5, C, D e E), e Q2 se truva visin al sit de ligam QB (Figura 5, C, D) e F). I residu L-Trp143 e L-Trp269 cunservà sun parècc visin a Q1 e Q2 e dan putenziai interaziun de impilament π (Figura 5, E e F e Figura S12). L-Gln88, 3,0 Å de l’ossijen distal de Q1, al forniss un ligam de idrojen fort (Figura 5E); chestu residuo l’è cunservà en tüt i RC senza la relaziun püsee luntana (Figura S13). L-Ser91 l’è sostituid conservativament de Thr ind la major part dei oltr RC (Figura S13), l’è 3,8 Angstrom de l’ossijen metil de Q1 e al pœl fornir ligam de idrojen debol (Figura 5E). Q3 al someia miga haver-g una interazion specifega, ma al se trova ind la rejon idrofoba intra la sotunitaa RC-M e la sotunitaa LH1-α 5 a 6 (Figura 5, D e G). Anca Q1, Q2 e Q3 o quinon chelad visin sun stà risolt en Tch. Gentil, Trv. Cepp 970 e Blc. La strutura de l’iris (9, 10, 12) la ponta a un sit de ligament de la chinona ausiliaria conservad ind el compless RC-LH1 (Figura S12G). I ciinch UQ decompost en RC-LH116 sun en bon acord cunt el 5,8±0,7 de ogni cumpless determinà de la cromatografia a liquid a volta rendiment (HPLC), menter i tri UQ decompost en RC-LH114-W sun inferiur a El valur misurà de 6,2±0,3 l’indica S strutura.
I polipeptids L e M pseudo-simetreg contegnen ciasqedun cinq TMH e formen un eterodimer qe al combina un dimer BChl, duu monomer BChl, duu monomer bateriofag (BPh) e un ferr miga Eme e una o duu molecole UQ10. A travers la presenza de ligam de idrojen sul grup de cetone terminal e la soa accumulazion cognossuda in Rps, i carotenoids inn incorporads ind la sotunitaa M, qe l’è ciamada cis-3,4-deidrorodopina. Spece (25). El domini de la membrana esterna de RC-H l’è ancorad a la membrana de un singol TMH. La strutura complessiva del RC l’è simil ai tri sotunitaa RC dei spece imparentade (comè Rba). sferoid (ID PDB: 3I4D). I macrocicli de BChl e BPh, la spina dorsal carotenoid e el ferr minga eme se soraponden denter del interval de resoluziun de chesti strütür, inscì cuma el grupp de cò UQ10 in del sit QA e la chinona QB in del RC-LH116 (Figura S15).
La disponibilitaa de duu struture RC cont divers tass de ocupazion del sit QB la forniss una nœva oportunitaa per esaminar i cambiaments conformazionai coerents qe compagnen el legam de la chinona QB. Ind el compless RC-LH116, la chinona QB la se trœva ind la posizion “prossimal” completament ligada (26), ma la separazion de RC-LH114-W la g’ha miga una chinona QB. G’è no una chinona QB in RC-LH114-W, qe l’è sorprendent perqè el compless l’è ativ, plussee qe el compless RC-LH116 cont una chinona QB struturalment risolta. Anca se i duu anei LH1 chelaten incirca ses quinon, cinq inn struturalment risolts ind l’anel RC-LH116 sarad, inscambi domà tri inn struturalment limitads ind l’anel RC-LH114-W avert. Qell disturb strutural aumentad qì al pœl rifleter la sostituzion plussee rapida dei sits QB RC-LH114-W, la cinetega plussee rapida dei chinone ind el compless e l'aument de la probabilitaa de incroxiar el circol LH1. Sugerimo che la mancanza de UQ in del sit QB RC de RC-LH114-W pœu vèss el resultà de un cumpless püsee cumpless e püsee atif, e el sit QB de RC-LH114-W l’è stà subit cungelà in del turnover UQ El stadi specifich (l’entrada al sit QB l’è stà sarada a chesta conformaziun) rif.
Senza QB, la rotazion compagna de L-Phe217 ind una posizion qe l’è incompatibel col ligam UQ10, perqè la causarà una collision spazial cont la prima unitaa de isoprene de la coa (Figura 6A). De soraplu, i ovvi cambiaments conformazionai principai inn ovvi, in particolar l'elica de (elica curta ind el circol intra TMH D e E) indov qe L-Phe217 l'è spostad ind la pòssa de ligament QB e la rotazion de L-Tyr223 (Figura 6A) Per romper el ligam de idrojen cont el quader de ligament QB e el M-4. sit (Figura 6B). L’elica de pivot a la sò bas, el Cα de L-Ser209 l’è spustà de 0,33 Å, menter el L-Val221Cα l’è spustà de 3,52 Å. G’he sun no cambiament osservabil en TMH D e E, che sun soraponibil en tüt i dü strütür (Figura 6A). Per quant che savèm, chesta l’è la prima strütüra in del RC natüral che sara el sit QB. Un confront cont la strutura completa (ligada a QB) al mostra qe inanz qe el chinon al se reduss, l’è necessari un cambiament conformazional per far-l entrar ind el chinon. El L-Phe217 al roda per formar un'interazion de impilament π cont el grup de la testa de quinona, e l'elica la se sposta vers l'estern, permetend a'l sqeletr de L-Gly222 e a la cadena laterala de L-Tyr223 de formar una red de ligam de idrojen cont una strutura de ligam de idrojen stabel (Figura 6, A e C).
(A) Cartoon sorapost de ologramm (cadena L, cadena naranz/M, magenta) e strütüra apo (gris), induè i residu ciaf sun mustrà sotta furma de rapresentaziun a verga. UQ10 l’è rapresentà de una barra gialla. La linea puntegiada l’indica i ligam de idrojen formads ind l’intera strutura. (B e C) La rapresentazion superfiçal de l'apolipoproteina e de l'intera strutura a anell, qe la met in evidenza l'ossijen de la cadena lateral de L-Phe217 in blu e L-Tyr223 in ross, rispetivament. La sotunità L l’è naranz; i sotunità M e H sun minga culurà. (D e E) Sit QB RC de apolipoproteina (D) e interi (E) [rispettivament culur da (A)] e Termofil termofil PSII (verd, blu cun chinona plastega; ID PDB: 3WU2) Allinear (58).
Inaspetà, anca se sun dispunibel diferent strütür de RC cun carenza de QB senza LH1, i cambiament confurmaziunai osservad en chestu stüdi sun stà minga segnalà prima. Chesti includen la strütüra de esauriment QB de Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepido (ID PDB: 1OJ) (28) e Rba. sferoid (PDB ID: 1OGV) (29), che sun tüt quasi istess a luur strütüra QB cumplesiva. Un’ispezion atenta de 3PRC l’ha rivelad qe i molecole de detergent LDAO (ossid de lauril dimetil amina) se ligan a l’entrada de la posizion QB, qe al pœl prevegnir el riorganizament ind una conformazion sarada. Anca se el LDAO se decompon no in de la stess posiziun en 1EYS o en 1OGV, chesti RC sun preparà duperand l’istess detergent e donca pœden avegh l’istess effett. La strutura cristallin de Rba. I sferoids RC co-cristalizads cont el citocrom c2 (ID PDB: 1L9B) par anca haver-g un sit QB sarad. Comesessia, in qell cas qì, la rejon N-terminal del polipeptid RC-M (qe l’interajiss cont el sit de ligament QB a travers el ligam H del residu Tyr su l’elica Q) l’adota una conformazion innatural e el cambiament conformazional QB l’è miga ulteriorment esplorad (30). Quel che l’è rassicurant l’è che g’hem minga vist chestu tip de deformaziun del polipeptid M in de la strütüra RC-LH114-W, che l’è quasi istess a la regiun N-terminal de RC-LH116 RC. Varia anca che dopu l’eradicaziun del antena LH1 a bas de detergent, sun stà risolt i RC apolipoproteinich in del PDB, che g’ha eliminà i grupp interni de chinon e i lipidi in del spazi intra el RC e la superfiss interna del anel LH1 circustant (31, 32). RC resta funzional perqè conserva tuts i cofator, senza la chinona QB decomponibil, qe l’è men stabil e l’è despess perduda durant el process de preparazion (33). De soraplu, l’è cognossud qe la rimozion de LH1 e dei lipids cicleg natural de RC la pœl haver-g un impat sui fonzion, comè la durada scorta del stat P+QB separad de carega (31, 34, 35). Donca, pensem che l’esistenza del anel local LH1 che circonda el RC pœu mantegnir el sit QB “serrà”, preservand inscì l’ambient local visin al QB.
Anca se l'apolipoproteina (senza la chinona QB) e la strutura completa representen domà duu istantanee del rotazion del sit QB, plutost qe una sequenza de events, a g'è dei indicazion qe el legam al pœl vesser blocad per prevegnir el religament de l'idrochinona Per inibir l'inibizion del substrat. L'interazion de quinol e chinona vexin al sit QB de l'apolipoproteina la pœl vesser diferenta, qe la porta a'l so refud de part de RC. L'è stait per tant temp propost qe i cambiaments conformazionai jugen una part ind el ligam e ind la reduzion dei quinon. La capacitaa dei RC congelads de redur i chinon dop l’adattament scur l’è compromessa (36); La cristallografia a ragg X la mostra qe qell dann qì l’è dovud a’l fait qe i quinon QB inn intrapolads ind una conformazion “distala” a circa 4,5 Å de la posizion prossimal ativa (26) , 37). Sujerim qe qella conformazion qì de ligament distal l'è un'istantanea del stat intermedi intra l'apolipoproteina e la strutura a anell complet, qe la segue l'interazion inizial cont la chinona e l'avertura del sit QB.
El RC de tip II truvà in del cumpless PSII de certi bater fototrof e cianobater, algh e piant g’ha una conservaziun strütüral e funziunal (38). L’alineament strutural mustrà in de la figüra 6 (D e E) sottalinea la someianza intra i RC PSII e el sit QB del cumpless RC baterich. Chestu cunfront l’è stà per tant temp un mudel per stüdiar i sistèm streitament ligà de ligam e reduziun di quinon. I pubblicazion precedents hann sujerid qe i cambiaments conformazionai inn acompagnads de la reduzion PSII dei quinon (39, 40). Donca, cunsiderand la conservaziun evolutiva de RC, chestu mecanism de ligam minga osservà prima pœu vèss aplicabil anca al sit QB de PSII RC en piant fototrofich osigenà.
I cep Rps ΔpufW (delezion pufW miga marcada) e PufW-His (proteina-W marcada cont el terminal C 10x espressa del locus pufW natural). palustris CGA009 l’è stà descrivuu in del noster lavurà precedent (16). Chesti cep e el genitur isogen de tip selvadegh sun stà recuperà del cungeladur strisciand un nümer piscinin de celùl sü PYE (ognun 5 g liter -1) (cunservà en LB a -80 °C, cuntenent el 50% (p/v) de proteina de glicerol), estratt de lievit e succinat (% succinat) agar/w [15]. La placa l’è stada incubada durant la nott al scür a temperadüra ambient en cundiziun anaerobich e dopu illuminada cun lüs bianca (~50 μmolm-2 s-1) furnida di lampadin alogen OSRAM 116-W (RS Components, Regn Ünì) per 3 a 5 dì fin quand l’è cumparsa una singula colonia. Una singula colonia l’è stada duperada per inocular 10 ml de mez M22+ (41) integrà cun 0,1% (p/v) de acid casamino (en seguit indicà cuma M22). La cültüra l’è stada cultivada en cundiziun de bas usigen al scür a 34°C cun scuoter a 180 rpm per 48 our, e dopu 70 ml de la cültüra sun stà inoculà en istess cundiziun per 24 our. Una cültüra semiaerobich cunt un volum de 1 ml l’è duperada per inocular 30 ml de mez M22 en una buttiglia de veder trasparent universal a vid de 30 ml e irradiada cun agitaziun (~50μmolm-2 s-1) per 48 ur cunt una barra de mes’ciadura a forza magnetich steril. Donca 30 ml de la cültüra sun stà inoculà cun circa 1 liter de cültüra in di stess cundiziun, che l’è stà duperà per inoculà circa 9 liter de cültüra illuminà a ~200 μmolm-2 s-1 per 72 ur. I celùl sun stà recüperà per centrifugaziun a 7132 RCF per 30 minut, risuspendü en ~10 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e cunservà a -20°C fin quand l’è stà necessari.
Dopu el disgelo, giuntà di cristai de desossiribonucleasi I (Merck, Regn Ünì), lisozima (Merck, Regn Ünì) e dü pastigli inibitur de la proteasi del oloenzima Roche (Merck, Regn Ünì) ai celùl risuspendü. En una celùla a presiun frances de 20.000 psi (Aminco, Stat Ünì), i celùl sun stà interrump de 8 a 12 volt. Dopu avegh cavà via i celùl minga interrumpì e i detriti insolubil travers centrifugaziun a 18.500 RCF per 15 minut a 4°C, la membrana l’è stada precipitada del lisaat pigmentà travers centrifugaziun a 113.000 RCF per 2 our a 43.000°C. Eliminar la fraziun solubil e risuspend la membrana culurada en 100 a 200 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e omogeneizar fin quand g’he sun no agregà visibil. La membrana suspenduda l’è stada incubada en tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, Stat Ünì) che g’ha denter el 2% (p/v) de β-DDM per 1 ura al scür a 4°C cunt una ligera mes’ciadura. Quind centrifuga a 70°C per deslenguar 150.000 RCF a 4°C per 1 ora per scancelà i insolubil residui.
La membrana solubilizant del cep ΔpufW l’è stada aplicada a una culonn de scambi ionich de sefarosa DEAE de 50 ml cun tri volum de culonn (CV) de tampon de ligam [20 mM tris-HCl (pH 8,0) che g’ha denter el 0,03% (p/v) β-DDM]. Lavar la culonna cun dü tampon de ligam CV e dopu lavar la culonn cun dü tampon de ligam che g’han denter 50 mM NaCl. El cumpless RC-LH116 l’è stà eluì cunt un gradient linear de 150 a 300 mM NaCl (en tampon de ligam) sü 1,75 CV e el cumpless de ligam restant l’è stà eluì cunt un tampon de ligam che g’ha denter 300 mM NaCl sü 0,5 CV. Raccògli el spettru de assorbiment intra 250 e 1000 nm, mantegni la fraziun cunt el raport de assorbiment (A880/A280) magiur de 1 a 880 a 280 nm, diluil dü volt in del tampon de ligam e dupera ancamò l’istess procedüra sü la culona DEAE Sü la purificaziun. Diluir i fraziun cun raport A880/A280 superiur a 1,7 e raport A880/A805 superiur a 3,0, eseguir el terz gir de scambi ionic e cunservar i fraziun cun raport A880/A280 superiur a 2,2 e raport A880/A805 superiur a 0.0. El cumpless parzialment purificà l’è stà cuncentrà a ~2 ml en un filter centrifug limit del pes molecùlar Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, Regn Ünì) e caricà sü una culonn de esclusiun de dimensiun Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, Stat Ünì) che g’haveva denter 200 ml 1,5 CV. Raccògli i spettri de assorbiment de la fraziun de esclusiun di dimensiun e cuncentra i spettri de assorbiment cun raport A880/A280 sü 2,4 e raport A880/A805 sü 5,8 a 100 A880 e duperal subit per la preparaziun o el cunservaziun de la griglia crio-TEM fin a -8°C.
La membrana solubilizant del cep PufW-His l’è stada aplicà a una culonn de sefarosi Ni-NTA FF HisPrep de 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) che g’ha denter 200 mM NaCl e 0,03% (p/p)) en tampon IMAC (GECA). v) β-DDM]. La culona l’è stada lavada cun ciinch CV de tampon IMAC e dopu cun ciinch CV de tampon IMAC che g’haveva denter 10 mM de istidina. El cumpless del nucleo l’è stà eluì de la culona cun ciinch tampon IMAC che g’havevan denter 100 mM de istidina. La fraziun che g’ha denter el cumpless RC-LH114-W l’è cuncentrada a ~10 ml en un serbatoi mes’cià dotà de un filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, Regn Ünì), diluida 20 volt cun tampon de ligam e dopu giuntà a 25 ml in del tampon DEAE b in anticipu. Lavar la culonna cun quater tampon de ligament CV, e dopu eluir el cumpless sü vòtt CV sü un gradient linear de 0 a 100 mM NaCl (en tampon de ligament), e i olter quater CV che g’han denter 100 mM de tampon de ligament I cumpless residui eluì sül sori8A20. superiur a 2,4 e el raport A880/A805 superiur a 4,6 fraziun sun stà cuncentrà a ~2 ml en un filter centrifug Amicon 100.000 MWCO, e riempì cun 1,5 CV IMAC en anticipo. 1,5 CV. Raccògli i spettri de assorbiment di fraziun dimensiun-esclusiun e cuncentra i spettri de assorbiment cun raport A880/A280 sü 2,1 e raport A880/A805 sü 4,6 a 100 A880, che sun subit duperà per la preparaziun de la red TEM cungelada o cunservà fin a -80°C.
Un congelador a imersiun Leica EM GP l’è stà duperà per preparar grigli TEM a bassa temperadüra. El cumpless l’è stà diluì en tampon IMAC a A880 de 50 e dopu 5 μl l’è stà caricà sü una red de ram rivestida de carbonio QUANTIFOIL 1,2/1,3 nœuvament scaricada a lux (Agar Scientific, Regn Ünì). Incubà la griglia a 20°C e 60% de ümidità relatif per 30 s, dopu sbucciala per 3 s e dopu s’alzala en etan liquid a -176°C.
I dati del cumpless RC-LH114-W sun stà registrà sül eBIC (Centro eletronich de bioimaging) (surgent de lüs diamantada britannich) cunt un miscoscopi Titan Krios, che funziuna a una tensiun acelerà de 300kV, cunt un ingrandiment nominal de 130.000 energia Chosi de-2000 × e un Un Gatan 968 GIF Quantum cun rilevadur de picch K2 l’è stà duperà per registrar imagen en modalità de cuntegg per cattà sü di dat. La dimensiun del pixel calibrà l’è de 1,048 Å e el tass de dosi l’è de 3,83 e-Å-2s-1. L’ha catà sü el cinema in 11 segund e l’ha dividü in 40 part. Dupera la zona rivestida de carbonio per rifucalizar el microscopi e dopu cattà sü tri film per büs. In del tutal sun stà cattà sü 3130 film, cun di valur de defocalizaziun intra -1 e -3μm.
I dat per el cumpless RC-LH116 sun stà cattà sü duperand l’istess miscoscopi al laboratori de la biostrütüra de Asterbury (Università de Leeds, Regn Ünì). I dat sun stà cattà sü en modalità de cuntegg cunt un ingrandiment de 130 k e i dimensiun di pixel sun stà calibrà a 1,065 Å cunt una dos de 4,6 e-Å-2s-1. El cinema l’è stad registrad in 12 segund e dividü in 48 part. En tutal, sun stà cattà sü 3359 film, cun valur de defucalizaziun intra -1 e -3μm.
Tüt el elaboraziun di dat l’è fatt in del gasdott Relion 3.0 (42). Duperà Motioncorr 2 (43) per currègg el muviment del fass travers de la ponderaziun de la dosi e dopu duperà CTFFIND 4.1 (44) per determinar el parameter CTF (funziun de trasferiment de cuntrast). I fotomicrograf tipich dopu chesti fasi iniziai de lavuraziun sun mustrà in de la figüra 2. S16. El mudel de seleziun automatich l’è generà seleziunand manualment circa 250 pixel de 1000 partisel en un quader de 250 pixel e senza una clasificaziun bidimensiunal (2D) de riferiment, refüdand inscì quei clasificaziun che sudisfan la contaminaziun del campiun o che g’han no di carateristich evident. Pœ, la selezion automatega l’è staita faita su tute i microfotografie, e el RC-LH114-W l’era de 849.359 partixelle, e el compless RC-LH116 l’era de 476.547 partixelle. Tüt i partisel seleziunà g’han subì dü gir de clasificaziun 2D minga de riferiment e dopu ogni cursa, i partisel che incuntran l’area de carbonio, la contaminaziun del campiun, nissuna carateristich ovvia o partisel che se soraponden fortement sun refüdà, cunt el resultà de 772.033 (90,9%) e 359.578 partisel sun üs. Rispettivament RC-LH114-W e RC-LH116. El mudel de riferiment 3D inizial l’è stà generà duperand el metud de discendenza del gradient stocastich. Duperant el mudel inizial cuma riferiment, i partisel seleziunà sun clasificà en quater categurì en 3D. Duperant el mudel en chesta categuria cuma riferiment, eseguir una raffinaziun 3D süi partisel in de la categuria püsee grand, e dopu duperar el filter passa-bas inizial de 15Å per cuprir la zona del solvent, giuntà 6 pixel de bord moll e post-processar i pixel per currègg la funziun de trasferiment superiur del Mo. Per l’insema de dat RC-LH114-W, chestu mudel inizial l’è stà mudificà scanceland la densità fort ai bord de la maschera (discuness de la densità cumpless del nucleo in de la Chimera UCSF). I mudei risultant (i resoluziun de RC-LH114-W e RC-LH116 sun rispettivament 3,91 e 4,16 Å) sun duperà cuma riferiment per el segond gir de clasificaziun 3D. I partisel duperà sun ragruppà in de la class 3D inizial e g’han no una fort correlaziun cun la vicinanza. Soraposiziun o mancanza de carateristich strütürai evident. Dopu el segond gir de clasificaziun 3D, l’è stada seleziunada la categuria cun la püsee volta resoluziun [Per RC-LH114-W, una categuria l’è 377.703 partisel (44,5%), per RC-LH116, g’he sun dü categurì, en total de 260.752 partisel, allinean sultant W4. dopu la rotaziun inizial cunt una piscinina diferenza]. I partisel seleziunà sun re-estratt en una scatula de 400 pixel e rafinà travers de la raffinaziun 3D. La maschera solvent l’è generada duperand el filter passa-bas inizial de 15 Å, l’espansiun de la mapa de 3 pixel e la maschera morbida de 3 pixel. Duperant el raffinament CTF per partisel, la curreziun del muviment per partisel e el segond gir de raffinament CTF per partisel, el raffinament 3D, el mascherar solvent e el post-tratament sun fatt dopu ogni pas per raffinar ulteriorment la trama risultant. Duperant el valur de limit FSC (Coeficient de correlaziun de la cunchiglia de Fourier) de 0,143, i resoluziun di mudei final de RC-LH114-W e RC-LH116 sun rispettivament 2,65 e 2,80 Å. La cürva FSC del mudel final l’è mustrada in de la figüra 2. S17.
Tute i sequenze proteige inn scaricade de UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID uniprotet: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID uniprot: O83005); RC-M (PufM; ID Uniprot: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID uniprot: A0A4Z9); Proteina-W (PufW; ID UniProteina: Q6N1K3). El mudel svizzer (45) l’è stà duperà per costruir un mudel de omologia de RC, che g’ha denter i sequenz proteich de RC-L, RC-M e RC-H e la strütüra cristallin de Rba. sferoid RC l’è stà duperà cuma schema (ID PDB: 5LSE) (46). Duperà el strüment “mapa adatta” in de la Chimera UCSF per adatar el mudel generà a la mapa (47), mejiorar la strütüra proteich e el cofatur [4×BChl a (nom del residu de la biblioteca di monomeri = BCL), 2×BPh a (BPH), un o dü tip de UQ10 (U10), un iron minga eme) 3,4-diidroesacarbonilcolina (QAK)] duperar Coot (48) per giuntà. Cuma QAK l’è minga dispunibel in de la biblioteca di monomeri, l’è stà parametrizà duperand el strüment eLBOW en PHENIX (49).
Despœ, l’è staita costruida la sotunitaa LH1. Inizialment, el strüment de costruziun automatich en PHENIX (49) l’è stà duperà per costruir automaticamente part de la sequenza LH1 duperand la mapa e i sequenz de prutein LH1-α e LH1-β cuma input. Selezionar la sotunitaa LH1 plussee completa, estrar-la e carigar-la in Coot, jontar-la manualment la sequenza mancanta e rafinar-la manualment l’intera strutura inanz de jontar duu BCl a (BCL) e una spirilloxantina (CRT) [segond i Rps rilevant La densitaa del contenut del caroten LH1 e el cognossud. Spece (17)]. Copia la sotunità LH1 cumpleta e dupera el “Strument de mapa de docking” de la Chimera UCSF per docking in del area minga mudel visin de densità LH1 e dopu raffinala en Coot; ripeter el prucess fin quand tüt i sotunità LH1 sun stà mudelà. Per la strutura RC-LH114-W, cont l’estrazion de la densitaa miga atribuida ind el Coot, la proteina l’è segmentada dei olter components miga proteig ind la mapa de la Chimera USCF e el strument Autobuild l’è drovad per stabilir el modell inizial e la modellazion dei olter sotunitaa (proteina-W). In del FENIC (49). Aggiungi qual-sa-vöör sequenz mancant al mudel risultant en Coot (48), e dopu raffina manualment l’intera sotunità. La densità minga atribuida restant la se adata a la cumbinaziun di lipid (ID de biblioteca de monomer PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), detergent β-DDM (LMT) e molecul UQ10 (U10). Duperà l’otimizaziun PHENIX (49) e l’otimizaziun manual en Coot (48) per perfeziunar el mudel inizial cumplet fin quand i statistich del mudel e la qualità visiva de la cürva pœden no vèss ulteriorment mejiorà. Per finì, dupera LocScale (50) per affinar la mapa local e dopu eseguir diferent olter cicli de mudelaziun de la densità minga distribuida e del otimizaziun automatich e manual.
I respetiv peptids, cofator e oltr lipids e chinon ancollads denter dei so respetive densitaa inn mostrads ind i figure 1 e 2. S18 a S23. I informaziun statistich del mudel final sun mustrà in de la Tabela S1.
A men che l’è minga specificà olter, i spettri de assorbiment UV/Vis/NIR sun stà cattà sü un spettrofotometer Cary60 (Agilent, Stat Ünì) a intervai de 1 nm de 250 nm a 1000 nm e a un temp de integraziun de 0,1s.
Diluir el campiun en una cuvetta de quartz cunt un percors de 2 mm fin a A880 de 1 e cattà sü el spettru de assorbiment intra 400 e 1000 nm. I spett dicroich rudùunt sun stà cattà sü un spettrupolarimeter Jasco 810 (Jasco, Giapun) a intervai de 1 nm intra 400 nm e 950 nm a una velocità de scansiun de 20 nm min-1.
El coeficent de estinzion molar l’è determinad diluend el compless del nucli a un A880 de circa 50. Diluir el volum de 10μl in 990μl de tampon de ligament o metanol e catar subit el spetri de assorbiment per minimizar la degradazzion del BChl. El contenuu de BChl de ogni campiun de metanol l’è stà calculà dal cueficient de estinziun a 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1 e l’è stà determinà el cueficient de estinziun (51). Divider la cuncentraziun de BChl misurà per 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) per determinar la cuncentraziun cumpless del nucleo, che l’è dopu duperada per determinar el spettru de assorbiment del stess campiun cattà sü in del cueficient de estinziun del tampon. parallel. Sun stà fatt tri misuraziun ripetù per ogni campiun e l’assorbiment medi del massim BChl Qy l’è stà duperà per el calcul. El cueficient de estinziun de RC-LH114-W mesurà a 878 nm l’è 3280±140 mM-1 cm-1, menter el cueficient de estinziun de RC-LH116 mesurà a 880 nm l’è 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 l’è stà quantificà segond el metud en (52). En curt, la HPLC en fas inversa (RP-HPLC) l’è stada fada duperand el sistèm HPLC Agilent 1200. Sciogli circa 0,02 nmol de RC-LH116 o RC-LH114-W en 50μl de metanol:cloroform 50:50 che g’ha denter el 0,02% (p/v) de clorur de ferr e ingiettar l’ultrasfera de Beckman Coulter preequilibrà en mm1 40°C en solvent HPLC (80:20 metanol:2-propanol) sü una culonn de ×25 cm. Eseguir l’eluziun isocratich en un solvent HPLC per cuntrular l’assorbiment a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoid) e 780 nm (BChl) per 1 ura. El picc in del cromatogramm de 275 nm a 25,5 minut l’è stà integrà, che g’haveva no olter cumpost rilevabil. L’area integrada l’è duperada per calculà la quantità molar de UQ10 estratt cun riferiment a la cürva de calibraziun calculada dal inieziun de standard pur de 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Ogni campiun l’è stà analizà en tri copi e l’errur segnalà curispunt a la DS de la media.
Una soluziun che g’ha denter el cumpless RC-LH1 cunt un assorbiment massim de Qy de 0,1 l’è stada preparada cun citocrom c2 del cœur de cavall ridott de 30 μM (Merck, Regn Ünì) e de 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Regn Ünì). Tri campiun de 1 ml sun stà preparà a ogni cuncentraziun de UQ2 e incubà durant la nott al scür a 4°C per garantir un adatament cumplet al scür prima de la misuraziun. La soluziun l’è stada caricada en un spettrofotometer modular OLIS RSM1000 dotà de una red de 300 nm flama/500 linea, 1,24 mm de entrada, 0,12 mm de mezz e de 0,6 mm de uscita. Un filter passant luungh de 600 nm l’è mettuu a l’entrada del fototub del campiun e del tub del fotomultiplicatur de riferiment per escluder la lüs de ecitaziun. L’assorbiment l’è stà monitorà a 550 nm cunt un temp de integraziun de 0,15 s. La lüs de ecitaziun l’è emessa del LED M880F2 (diodo emitent de lüs) de 880 nm (Thorlabs Ltd., Regn Ünì) travers un cavo en fibra ottich a intensità del 90% travers un reguladur DC2200 (Thorlabs Ltd., Regn Ünì) e l’è emessa a la surgent lüminùs de 9°0. El fass de misuraziun l’è opost al specc per restituir qual-sa-vöör lüs che inizialment l’è minga stada assorbida del campiun. Monitor l’assorbiment 10 s prima del illuminaziun de 50 s. Donca l’assorbiment l’è stà ulteriorment monitorà per 60 s al scür per valutar la misura en cui el quinolol reduss spuntaneament el citocrom c23 + (vardà la figüra S8 per i dat grezz).
I dati sun stà elaborà adattand un tass inizial linear enter 0,5 a 10 s (a segond de la cuncentraziun de UQ2) e mediand i tass di tüt i tri campiun a ogni cuncentraziun de UQ2. La cuncentraziun RC-LH1 calculada dal respetif cueficient de estinziun l’è stada duperada per cunvertir el tass in del eficienza catalitich, tratà en Origin Pro 2019 (OriginLab, Stat Ünì) e adatada al mudel Michaelis-Menten per determinar i valur aparent de Km e Kcat.
Per i misuraziun de assorbiment transitori, el campiun RC-LH1 l’è stà diluì a ~2 μM en tampon IMAC che g’ha denter 50 mM de ascorbat de sodi (Merck, Stat Ünì) e 0,4 mM de terbutina (Merck, Stat Ünì). L’acid ascorbich l’è duperà cuma donatur de eletrun sacrificial e el tert-butaclofen l’è duperà cuma inibitur QB per garantir che el donatur principal RC resta redut (cioè minga fotoossidà) durant tüt el prucess de misuraziun. Circa 3 ml de campiun sun giuntà a una celùla rotant personalizada (circa 0,1 m de diameter, 350 RPM) cunt una luungheza del percors ottich de 2 mm per garantir che el campiun in del percors laser g’ha temp sufisent per l’adattament scür intra impuls de ecitaziun. Duperà impuls laser de ~100 fs per amplificar el sistèm laser Ti: Zaffiro (Spectra Physics, Stat Ünì) per ecità el campiun a 880 nm a un tass de ripetiziun de 1 kHz (20 nJ per NIR o 100 nJ per Vis). Prima de cattà sü i dat, espon el campiun a la lüs de ecitaziun per circa 30 minut. L’esposiziun causarà l’inativaziun de la QA (forsi reducend la QA una o dü volt). Ma nota che chestu prucess l’è reversibil perché dopu un luungh periud de adatament scür, RC turnarà lentament al atività de QA. Un spettrometer Helios (Sistemi Ultraveloci, Stat Ünì) l’è stà duperà per mesurar i spettr transient cunt un temp de ritardo de -10 a 7000 ps. Dupera el prugrama Surface Xplorer (Sistemi Ultrafast, Stat Ünì) per desgruppà i set di dat, e dopu giontar e standardizar. Dupera el pachet software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) per duperà l’insema di dat cumbinà per utener spettr diferenziai ligà al decadiment, o duperar una funziun che interesa plü espunent cun la rispòsta del strüment per adatass a l’evoluziun spettral a luungheza d’unda singula en UriginLa (Urigin Stat Ünì).
Comè dit sora (53), l’è stà preparà un film fotosintetich che g’ha denter un cumpless LH1 senza antena RC e LH2 periferich. La membrana l’è stada diluida en tris 20 mM (pH 8,0) e dopu caricada en una cuvetta de quartz cunt un percors ottich de 2 mm. Un impuls laser de 30nJ l’è stà duperà per ecità el campiun a 540 nm cunt un temp de ritardo de -10 a 7000 ps. Elabora l’insema di dati cuma descrivuu per Rps. pal campion.
La membrana l’è stada pelletizada per centrifugaziun a 150.000 RCF per 2 our a 4°C e dopu el sò assorbiment a 880 nm l’è stà risuspendü en 20 mM tris-HCl (pH 8,0) e 200 mM NaCl. Scioglier la membrana remesciand lentament in del 2% (p/v) β-DDM per 1 ora al scür a 4°C. El campiun l’è stà diluì en carbonat de trietilamonio 100 mM (pH 8,0) (TEAB; Merck, Regn Ünì) a una cuncentraziun proteich de 2,5 mg ml-1 (analìs Bio-Rad). Ulterior lavuraziun l’è stada fada dal metud püblicà prima (54), a partir de la diluiziun de 50 μg de prutein en un total de 50 μl de TEAB che g’ha denter l’1% (p/v) de laurat de sodi (Merck, Regn Ünì). Dopu la sonicaziun per 60 s, l’è stà redut cun 5 mM tris (2-carbossietil)fosfina (Merck, Regn Ünì) a 37°C per 30 minut. Per l’alchilaziun S, incuba el campiun cun 10 mM de metil S-metiltiometansulfonà (Merck, Regn Ünì) e giuntal de una soluziun de riserva de isopropanol de 200 mM per 10 minut a temperadüra ambient. La digestion proteolitich l’è stada fada cun l’agiunta de 2 μg de mistura de tripsina/endoproteinasi Lys-C (Promega UK) e incubada a 37°C per 3 our. El tensioattif laurà l’è stà estratt giuntant 50 μl de acetà de etil e 10 μl de acid trifluoroacetich de grad LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Regn Ünì) e vortexand per 60 s. La separaziun di fas l’è stada promossa de la centrifugaziun a 15.700 RCF per 5 minut. Segond el protocoll del produtur, una culonn de spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Regn Ünì) l’è stada duperada per aspirar e desalar cun atenziun la fas inferiur che g’ha denter el peptid. Dopu l’asciugament per centrifugaziun a vœui, el campiun l’è stà dissolt in del 0,5% de TFA e in del 3% de acetonitril e 500 ng sun stà analizà cun la cromatografia RP a nanofluss acùppiada cun la spettrometria de mass duperand i parameter del sistèm detaglià prima.
Duperà MaxQuant v.1.5.3.30 (56) per l’identificaziun e la quantificaziun di prutein per cercar Rps. base de dati del proteoma del palustris (proteoma). I dati proteomich de la spettrometria de mass sun stà deposità in del Alleanza ProteomeXchange travers el repositori partner PRIDE sotta l’identificatur del insema de dati PXD020402.
Per l’analis travers RPLC acoppià cun la spettrometria de mass de ionizaziun eletrospray, el cumpless RC-LH1 l’è stà preparà de Rps de tip selvadegh. Duperant el metud püblicà prima (16), la cuncentraziun de prutein prodott en i celùl de palustris l’era de 2 mg ml-1 en 20 mM de Hepes (pH 7,8), 100 mM de NaCl e 0,03% (p/v) β- (analìs Bio-Rad) ) DDM. Segond el protocoll del produtur, dupera el kit de purificaziun 2D (GE Healthcare, Stat Ünì) per estrar 10 μg de prutein cun metud de precipitaziun e deslenguar el precipitat en 20 μl de acid formich (FA) al 60% (v/v), acetonitril al 20% (v/v) e aqua (aqua) al 20% (v/v). Cinq microliter sun stà analizà cun RPLC (RSLC Dionex) acùppià cun spettrometria de mass (Maxis UHR-TOF, Bruker). Duperà una culonn MabPac de 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Regn Ünì) per la separaziun a 60°C e 100 μlmin -1, cunt un gradient del 85% (v/v) de solvent A [0,1%(v/v) FA e 0,02%(v/v) en TFA acetonitril al 90%(v/v]] Duperant la funt de ionizaziun eletrospray standard e i parameter predefinì per püsee de 60 minut, el spettrometer de mass utèn de 100 a 2750 m/z (raport masa-carica). Cun l’aiut del strüment FindPept del purtal di risurs bioinfurmatich ExPASy, mapa el spettru de mass ai sottaunità del cumpless.
I celùl sun stà cressü per 72 our sotta 100 ml de lüs NF-bass (10 μMm-2 s-1), media (30 μMm-2 s-1) o volt (300 μMm-2 s-1). Medium M22 (medio M22 induè el sulfat de amonio l’è omess e el succinat de sodi l’è sostituì del acetà de sodi) en una buttiglia a vid de 100 ml (23). En ciinch cicli de 30 s, perlin de veder de 0,1 micron sun stà perlinà a un raport de volum de 1:1 per lisar i celùl e rinfredà sü giasc per 5 minut. La materia insolubil, i celùl minga interrumpì e i perlin de veder sun stà eliminà per centrifugaziun a 16.000 RCF per 10 minut en una microcentrifuga de banch. La membrana l’è stada separada en un rotor Ti 70,1 cun 100.000 RCF en tris-HCl 20 mM (pH 8,0) cunt un gradient de sacarosio al 40/15% (p/p) per 10 our.
Comè descrivuu in del noster lavurà precedent, l’imunorilevament del tag His sü PufW (16). En curt, el cumpless del nucleo purificà (11,8 nM) o la membrana che g’ha denter l’istess cuncentraziun de RC (determinada del ossidaziun che leva el spettru di diferenzi ridott e che currispunt al carich sül gel culurà) en tampon de caricament SDS 2x (Merck, Regn Ünì) diluì dü volt. I protein inn staite separade su una replica de jel NuPage bis-tris al 12% (Thermo Fisher Scientific, Regn Unid). Un gel l’è stà culurà cun blu brillant Coomassie (Bio-Rad, Regn Ünì) per caricar e visualizar la sotunità RC-L. La proteina sül segond gel l’è stada trasferida a la membrana de fluorur de poliviniliden ativà al metanol (Thermo Fisher Scientific, Regn Ünì) per l’imunotest. La membrana PVDF l’è stada blocada en 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 e 5% (p/v) en polvar de latt scremà, e dopu incubada cun l’anticorp primari anti-His (en tampon mH5l 7,6), 150 mM NaCl e 0,05% (v/v) Tween-20] en 1:1000 A190-114A, laboratori de betil, Stat Ünì) per 4 our. Dopu el lavagg 3 volt per 5 minut en tampon de anticorp, la membrana l’è stada cumbinà cun anticorp segondari anti-rat perossidasi de ravanell (Sigma-Aldrich, Regn Ünì) (diluì 1:10.000 en tampon de anticorp) W incuba per cunsentir el rilevament (5 minut dopu 3 lavagg en tampon de anticorp chimino CEST0). (Cyanagen, Italia) e Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Regn Ünì).
Disegnand la distribuziun del intensità de ogni gel culurà o corsia de imunotest, integrand l’area sotta el picc e calculand el raport de intensità de RC-L (gel culurà) e Protein-W (imunotest), en ImageJ (57) Elabura l’imagen. Chesti raport sun stà cunvertì en raport molar pensand che el raport intra RC-L e proteina-W in del campiun pur RC-LH114-W l’era 1:1 e nurmalizand di conseguenza tüt el insema de dat.
Per i materiai suplementar per chestu articul, varda http://
Chestu l’è un articul a acess avèrt distribuì ai termin de la licenza de attribuziun Creative Commons. L’articul permet un üs, una distribuziun e una riproduziun senza limitaziun en qual-sa-vöör mez a cundiziun che l’oper uriginal l’è citad en mod giüst.
Nota: Ti dumandem sultant de furnir el tò indiriz e-mail inscì che la persuna che te racumandi a la pagina la sa che te vœut che la veda l’e-mail e che l’è minga spam. Catturem no nissun indiriz e-mail.
Chesta dumanda l’è duperada per verificar se l’è un visitant e per evitar l’invio automatich de spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F.
La strutura a volta resoluzion del compless de la trapola de la lux 1 ind el center de reazion la forniss nœve informazion su la dinamega de la chinona.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F.
La strutura a volta resoluzion del compless de la trapola de la lux 1 ind el center de reazion la forniss nœve informazion su la dinamega de la chinona.
©2021 Asociaziun americana per el prugress de la scienza. tutti i diritti riservati. AAAS l'è un partner de HINARI, AGORA, OARE, COR, CLOCKSS, Riferiment incrocià e CONTADOR. Avanzament de la Scienza ISSN 2375-2548.